一株具有纤维素酶活性细菌菌株的鉴定及其生物学活性

丁泽力, 周 挺, 顾 钢, 季梦婷, 李春英, 蔡学清

(1.福建农林大学植物保护学院,福建 福州 350002;2.福建省烟草公司烟草科学研究所,福建 福州 350003)

田间杂草不仅与作物争夺养分,还是植物病原菌的携带者以及中间寄主或桥梁寄主,如小蘖和十大功劳是秆锈菌的转主寄主,小乌头和唐松草是叶锈菌的转主寄主[1];腋花蓼、红辣蓼、空心莲子草、香附子、鳢肠、胜红蓟、牛繁缕、马齿苋、千金子、看麦娘和辣子草等杂草根部可携带烟草青枯菌[2]。这类有害生物的防除成本高,若采用化学药剂除草可能造成杂草的抗药性增强和土壤微生物失衡、环境污染[3-4]等生态问题。微生物可以通过内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等纤维素酶水解植物的秸秆纤维素而达到腐解的目的[5]。因此,寻找合适的微生物无害化腐解杂草,破坏中间转主寄生链条,既能防除杂草又能防控病害,是农业病虫草害绿色防控的研究方向。

自然界中,真菌[6-8]、细菌[9-10]、放线菌[11]等都可以分泌纤维素酶。金晓丽[8]从西藏不同生境的样品中筛选获得的白腐真菌TrametesW-4的纤维素酶活性高达3.05 U·mL-1,可对秸秆、牛粪、猪粪等农林废弃物进行厌氧发酵;郭玲玲等[10]从育苗基质中分离并筛选到1株耐高温、产纤维素酶的芽胞杆菌(Bacillus);薛藩[12]从秸秆还田土壤及牛粪、猪粪和蚯蚓粪等生境中筛选出具有纤维素酶活性的芽胞杆菌属(Bacillus)、类芽胞杆菌属(Paenibacillus)细菌,以及毛孢子菌属(Trichosporon)、链格孢属(Alternaria)和木霉属(Trichoderma)等真菌。植物内生细菌也可产纤维素酶及分泌具有抑菌活性的物质,本课题组从烟草茎秆分离的内生解淀粉芽胞杆菌TB2 (Bacillusamyloliquefaciens)菌株具有纤维素酶活性,且对辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsica)、黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)、青枯病菌(Ralstoniapseudosolanacearum)、荔枝霜疫霉菌(Peronoplasmoparalitchii)等具有抑菌活性[13-14];另外,该细菌对荔枝霜疫病的防效与其定殖量有关[14]。

本研究以空心莲子草和辣蓼草[3]以及作物青枯病菌[15]为研究对象,拟从本实验室构建的叶际微生物库中筛选具有纤维素酶活性的菌株,并探究其对农田杂草腐解和青枯菌的抑菌作用,以期为作物青枯病防治和杂草防除提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 2022—2023年,在福建农林大学细菌学实验室进行具有纤维素酶活性菌株的筛选与鉴定。供试菌株由本课题组分离保存,包括162株叶际细菌菌株、烟草青枯菌、番茄青枯菌、甘薯青枯菌和辣椒青枯菌。

1.1.2 供试培养基 包括NA培养基、NB培养基(不加琼脂的NA培养基)、LB培养基以及纤维素酶培养基(CMC固体培养基)。LB培养基中添加5 g·L-1羧甲基纤维素钠和0.1 g·L-1“台盼蓝”,即为CMC固体培养基。以上培养基均参照方中达[16]的方法进行配制,并于121 ℃灭菌20 min,备用。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌的培养 将供试细菌菌株在NA培养基平板上划线,28 ℃恒温培养24～48 h;挑取单菌落于NB培养基中,180 r·min-1振荡培养24～48 h,获得D600 nm值为2.0的菌悬液,备用。取1 mL菌悬液,12 000 r·min-1离心10 min,取其上清液过滤除菌(0.22 μm),即为发酵滤液(代谢产物);在沉淀物中加入1 mL无菌水混匀,获得细菌菌体,将其D600 nm值调为2.0,备用。

1.2.2 具有纤维素酶活性菌株的筛选 参照范晓静等[17]的方法,采用点滴法进行筛选。用移液枪吸取5 μL菌悬液点滴在CMC固体培养基上,每个供试菌株3次重复。

1.2.3 菌株H16菌悬液、细菌菌体及代谢产物的纤维素酶活性测定 采用点滴法测定菌悬液和细菌菌体的纤维素酶活性,具体参照1.2.2的方法。采用纸片法测定代谢产物的纤维素酶活性[10],将无菌滤纸片(半径2 mm)在发酵滤液中浸泡5 min,用无菌镊子夹取滤纸片贴在CMC固体平板培养基上。每个处理3次重复。

1.2.4 H16菌株的鉴定 (1)形态学鉴定。供试菌株接种于NA固体培养基平板,28 ℃培养24 h,观察菌落形态。参照杨丙烨等[18]的方法,采用磷钨酸负染法染色并在透射电子显微镜(Hitachi HT7700)下观察鞭毛。(2)生理生化测定。硝酸钾还原反应、过氧化氢酶反应、氧化酶反应、淀粉水解、甲基红试验、吲哚的产生、丙二酸钠和柠檬酸钠利用、3%KOH溶解,均参照方中达[16]的方法;果聚糖利用和精氨酸双水解酶的测定参照东秀珠等[19]的方法;参照Huang et al[20]的方法测定糖醇类物质(海藻糖、麦芽糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、葡萄糖、阿拉伯糖和纤维二糖)的利用。(3)16s rDNA鉴定。用16S rDNA基因通用引物27F/1492R (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′/5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)对供试菌株进行PCR扩增,具体扩增体系和扩增条件参照Lane[21]的方法。对扩增结果进行电泳分析,条带大小验证正确后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序,所得序列输入NCBI数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/),并用BLAST软件比对分析。采用MEGA 7.0软件进行多重序列比对分析,用邻接法(neighbor-joining method, NJ)构建系统发育树。

1.2.5 H16菌株对青枯菌的抑菌测定 参照刘伟等[22]的方法。按1%比例分别将不同作物的青枯菌悬浮液加入NA培养基中,混匀,制成带菌的培养基平板,分别点滴5 μL H16菌悬液(D600 nm=2.0)。每个处理3次重复,培养4 d后测量抑菌圈的大小。

1.2.6 H16菌株对空心莲子草和辣蓼草的腐解作用测定 取新鲜无病的空心莲子草和辣蓼草,洗净沥干水分,切成每段约7 cm长;分别称取25 g,置于无菌500 mL锥形瓶中,分别加入5种浓度的H16菌悬液,常温浸泡,观察并记录杂草腐解情况。5种浓度即处理1～处理5分别为：250 mL原液,D600 nm=2.0;165 mL原液+85 mL无菌水,即将原液稀释2/3倍;125 mL原液+125 mL无菌水,即将原液稀释1倍;250 mL NB培养基;以250 mL无菌水为对照。

2 结果与分析

2.1 具有纤维素酶活性细菌菌株的筛选结果

通过平板测定,从162株叶际细菌菌株中获得15株具有纤维素酶活性的菌株,占比9.26%。其中,分离自凹头苋(Amaranthuslividus)的菌株H16的纤维素酶活性较好,透明圈半径3 mm(图1);菌体和代谢产物也有纤维素酶活性,透明圈半径均为3 mm。综合评价后,从15株产酶能力不同的菌株中选取H16菌株开展后续试验。

图1 H16菌株的纤维素酶活性Figure 1 Cellulase activity of strain H16

2.2 H16菌株的鉴定

2.2.1 形态特征 革兰氏阴性菌,菌体短杆状,端圆,大小为0.5～0.8 μm×0.9～2.0 μm;NA培养基平板上的菌落红色,圆形,表面湿润、边缘整齐(图2A);电子显微镜下可见侧生鞭毛4～8根(图2B)。

A.NA培养基上培养24 h的菌落形态;B.鞭毛(12 000×)。图2 H16菌株的形态特征Figure 2 Morphological characteristics of strain H16

2.2.2 生理生化特征 生理生化及碳水化合物利用结果(表1)显示,H16菌株能利用海藻糖、麦芽糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇和葡萄糖,不能利用阿拉伯糖、纤维二糖、柠檬酸钠及丙二酸钠;硝酸钾还原反应、过氧化氢酶反应、氧化酶反应、淀粉水解、精氨酸双水解酶、甲基红试验和吲哚的产生、KOH溶解均为阳性;果聚糖利用为阴性。

表1 H16菌株的生理生化和碳水化合物利用结果1)

2.2.3 16S rDNA基因序列分析 通过PCR扩增并测序,获得H16菌株16S rDNA基因的核苷酸序列长度为1 461 bp。在NCBI数据库上进行在线同源性比对发现,H16菌株的16S rDNA序列与嗜线虫沙雷氏菌(Serratianematodiphila)16S rDNA部分序列同源性达98%以上。用邻接法构建系统发育进化树(图3),结果显示,H16菌株与嗜线虫沙雷氏菌S.nematodiphilaDZ0503SBS1T菌株处于同一分支。因此,将该菌株鉴定为嗜线虫沙雷氏菌。

图3 基于16S rDNA序列构建H16菌株的系统发育进化树Figure 3 Phylogenetic tree of strain H16 based on 16S rDNA sequences

2.3 H16菌株对青枯菌的拮抗活性

平板抑菌实验显示,H16菌株对烟草青枯菌和辣椒青枯菌(图4)有抑菌作用,抑菌圈半径分别为4.0、1.5 mm,但对甘薯青枯菌和番茄青枯菌没有抑菌效果。

A.烟草青枯菌;B.辣椒青枯菌。图4 接种4 d后H16菌株对烟草青枯菌和辣椒青枯菌的抑菌效果Figure 4 Bacteriostatic effect of strain H16 on R.pseudosolanacearum of tobacco and hot pepper at day 4 after inoculation

2.4 H16菌株对空心莲子草和辣蓼草的腐解效果

对空心莲子草和辣蓼草的腐解试验表明,H16菌株可快速腐解这2种杂草(表2)。用菌悬液原液(处理1)浸泡3 d后,空心莲子草和辣蓼草发黑变软,分别腐解40%和80%;4 d后辣蓼草全部腐解,5 d后空心莲子草也全部腐解。用NB培养基浸泡的处理4则在7～8 d后全部腐解,无菌水(CK)浸泡的处理5需10 d以上才全部腐解。从表2还可见,H16菌悬液稀释倍数越大,对杂草的腐解效果越差。浸泡3 d后,处理1(原液,D600 nm=2.0)对空心莲子草和辣蓼草的腐解效果最好,处理2(原液稀释2/3倍)次之,处理3(原液稀释1倍)再次之,表明稀释1倍的菌悬液对辣蓼草的腐解效果略好于处理4(NB培养基),但对空心莲子草的腐解效果与处理4无差异;处理2(原液稀释2/3倍)全部腐解辣蓼草和空心莲子草分别需要5 d和6 d,而处理3(原液稀释1倍)则需8 d以上。综上所述,H16菌株在低浓度下不能快速腐解杂草。

表2 H16菌株对辣蓼草和空心莲子草的腐解效果(浸泡3 d)1)

3 讨论

植物细胞壁的主要成分是纤维素和半纤维素[23-24],也是植物腐解过程中最主要的化学成分。已有研究表明,添加外源微生物可有效促进秸秆的降解[25]。据报道,沙雷氏菌可分泌包括纤维素酶在内的多种胞外酶[26],但产量少且多数不能分泌到细胞外[27]。本研究筛选的嗜线虫沙雷氏菌(S.nematodiphila)H16菌株具有较强的纤维素酶活性,尤其是代谢产物也具有纤维素酶活性,说明其分泌的胞外纤维素酶可直接作用于植物细胞壁,因而能快速腐解空心莲子草和辣蓼草。本研究中,H16菌株浸泡4～5 d后辣蓼草和空心莲子草全部腐解,其腐解效率明显高于傅慧静[28]从松墨天牛肠道分离的粘质沙雷氏菌(S.marcescens)对木质素的降解效率、李丹红等[29]从象白蚁(Nasutitermessp.)肠液分离的粘质沙雷氏菌(S.marcescens)以及哥本类芽胞杆菌属(Paenibacilluskobensi)混合菌群对纤维素的降解效率。微生物降解植物秸秆是一个连续的过程,是否还存在其他作用机制以及在腐解过程中杂草养分如何释放等都需要进一步研究。

秸秆腐解效率不仅与使用的微生物有关[25,30],还与有效活菌数有关[31]。本研究中,随着菌液稀释倍数增加,对杂草的腐解速率降低,如用H16菌株的菌液(D600 nm=2.0)浸泡处理4～5 d,辣蓼草和空心莲子草全部腐解,而菌液稀释1倍后,其腐解速率则与NB培养基处理无差异。造成该现象的原因可能与H16菌株生物量低,纤维素酶活力累积不足有关[32]。

沙雷氏菌(Serratiaspp.)是一类重要的生防菌,能分泌脂肽、灵菌红素、大环内酯类抗生素、嗜铁素、几丁质酶等多种次生代谢产物[33-34],具有生物修复[35]、抗细菌[36-37]、抗病毒[38-39]、抗真菌[40]、免疫调控[41]、杀虫[42]等多重有益生物学功能,已被证明可用于病虫的生物防治[33,37,39,42]。本研究显示,沙雷氏菌H16菌株对烟草和辣椒青枯菌有拮抗作用,但对甘薯青枯菌和番茄青枯菌没有拮抗作用。李霞等[37]报道从生姜连作地土壤中分离的沙雷氏菌R11对生姜青枯菌(R.solanacarum)具有较好的拮抗作用,其抑菌圈半径与H16菌株有差异。这可能由于来源于不同宿主的青枯菌生物学特性不同而造成;再者,本研究筛选的沙雷氏菌H16分离自凹头苋植株,而沙雷氏菌R11分离自生姜连作地土壤,所分离生境或微生态环境不同,获得的菌株生物学特性也可能不同。本研究仅研究菌株的抑菌作用,其他有益生物学功能及机理尚待进一步探讨。

4 结论

本研究通过点滴法筛选获得1株具有较强纤维素酶活性的H16菌株,用其菌悬液浸泡辣蓼草和空心莲子草4～5 d后,杂草全部腐解;另外,该菌株对烟草青枯菌和辣椒青枯菌具有拮抗作用。通过菌落形态特征、鞭毛数量及着生位置、生理生化测定结果以及16S rDNA序列和系统发育进化树分析,将该菌株鉴定为嗜线虫沙雷氏菌(S.nematodiphila)。本研究筛选获得的菌株可为杂草的生物防除及作物青枯病的绿色防控提供新的菌株资源。