杀菌剂对七叶一枝花灰霉病菌的室内毒力比较及田间防效

吴 媛, 周先治, 陈 阳, 林永胜

(1.厦门海关技术中心,福建 厦门 361026;2.福建省农业科学院农业生物资源研究所,福建 福州 350003)

重楼是传统名贵中药材,以干燥根茎入药,具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊的功效,临床上主要用于治疗疔疮痈肿、咽喉肿痛、蛇虫咬伤、跌扑伤痛、惊风抽搐等[1],是云南白药、宫血凝等70余种中成药的重要原料[2-4]。七叶一枝花(ParispolyphyllaSmith var.chinensis)作为重楼基原植物之一,收录于2020版《中国药典》[1]。七叶一枝花生长缓慢,药材以野生资源为主,但滥挖滥采导致其野生资源日趋匮乏[5]。当前,七叶一枝花已成为人工抚育的重点药材之一[6]。但随着人工栽培面积不断扩大,七叶一枝花灰霉病危害日趋严重。

灰霉病是由葡萄孢属(Botrytisspp.)真菌侵染所致,包含38个种[7],每年造成全球经济损失超过100亿美元[8]。七叶一枝花灰霉病是重楼葡萄孢(Botrytispolyphyllae)引起的真菌病害[9],主要侵染花器和幼嫩的叶部,平均发病率达50%左右,严重可达100%[9-10]。近年来,七叶一枝花在闽北、闽中等地区广泛种植,使得灰霉病发病率不断升高。据笔者调查,福建光泽地区灰霉病发病地块的病株率高达50%以上,严重影响七叶一枝花生产。目前,七叶一枝花灰霉病主要以化学防治为主,但该病菌并未登记专用杀菌剂,生产上盲目施药易导致其根茎农残超标[10-11]。因此,本研究选取7种杀菌剂对七叶一枝花灰霉病进行了室内药剂筛选和田间药效试验,以期筛选出可有效防治七叶一枝花灰霉病的杀菌剂。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病样采集 灰霉病样本于2017年4月采自福建省南平市光泽县崇仁乡崇仁村七叶一枝花种植基地。选取病株上具有典型灰霉症状的组织,剪下装入自封袋,备用。

1.1.2 供试药剂 25%啶菌噁唑乳油,由沈阳科创化学品有限公司生产;75%肟菌酯·戊唑醇水分散剂、43%戊唑醇悬浮剂、40%嘧霉胺悬浮剂,由拜耳作物(中国)有限公司生产;50%咯菌腈可湿性粉剂,由瑞士先正达作物保护有限公司生产;10%苯醚甲环唑水分散剂、50%腐霉利可湿性粉剂,由日本住友化学有限公司生产。供试药剂百分比均为质量分数。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的分离及纯化培养 采用含50 mg·L-1链霉素的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar, PDA)进行病原菌的分离与纯化。(1)PDA培养基的制备。将1 L PDA培养基经121 ℃灭菌20 min,待培养基温度降至60 ℃时加入50 mg·mL-1链霉素1 mL,混均后分装备用。(2)病原菌的分离与纯化。参照孙广宇等[12]的方法进行病原菌的分离与纯化。清洗病样组织并用75%酒精消毒,剪取病健交界处约5 mm×5 mm的组织块,置于空培养皿中并标记编号,依次用75%酒精和0.01 g·mL-1次氯酸钠溶液浸泡45 s和1 min,无菌水清洗3遍后吸干水分并置于PDA平板上。将培养皿倒置放入26 ℃、湿度为60%、全黑暗的人工气候培养箱,培养7 d后观察菌丝生长情况。(3)病原菌的纯化培养。挑取菌落并转移至新的PDA平板中,封口后置于26 ℃、湿度为60%、全黑暗的人工气候培养箱内。观察纯化培养后的菌落,若为单菌落且形态特征与文献[9]相符合则表示纯化成功。(4)菌株的保存。对培养7 d的纯化菌株进行拍照。挑取菌丝并转移至PDA冻存管斜面中,在26 ℃、湿度为60%、全黑暗的人工气候培养箱继续培养5～7 d。观察菌株的发育和污染情况,若被污染则继续保菌,若未污染且菌落长势良好则置于4 ℃冰箱冷藏保存。

1.2.2 室内毒力测定 采用菌丝生长速率法[12]对7种杀菌剂进行室内毒力测定。用无菌水将7种杀菌剂稀释为20 mg·mL-1母液备用,链霉素母液为50 mg·mL-1。待PDA培养基温度降低至60 ℃左右,分别加入各杀菌剂和链霉素。其中75%肟菌酯·戊唑醇和43%戊唑醇的终浓度分别为100、50、25、10和1 mg·L-1,10%苯醚甲环唑的终浓度分别为10、5、1、0.5和0.25 mg·L-1,25%啶菌噁唑、40%嘧霉胺、50%咯菌腈、50%腐霉利的终浓度分别为0.5、0.25、0.1、0.05和0.002 5 mg·L-1,链霉素终浓度为50 mg·L-1。以加入无菌水的PDA培养基(链霉素浓度为50 mg·L-1)作为空白对照,每个处理3次重复。将七叶一枝花灰霉菌用PDA平板活化72 h后,在菌落边缘打取直径为0.5 cm的菌饼,将有菌丝的一面朝下置于含药平板中央,倒置放入26 ℃、湿度60%、光周期为12 h光照/12 h黑暗的人工气候培养箱内。培养7 d后,采用十字交叉法量取菌落直径,并计算菌丝生长抑制率。菌丝生长抑制率/%=[(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)]×100。根据菌丝生长抑制率(x)和供试药剂的质量浓度对数(y)之间的关系,计算有效抑制中浓度(median effective concentration, EC50)、毒力回归方程(y=ax+b)、相关系数和95%置信限。

1.2.3 田间药效评估 试验地为光泽县寨里镇可坑村华重楼种植基地。该地七叶一枝花整体长势良好,仅个别植株发病。试验药剂为25%啶菌噁唑乳油、40%嘧霉胺悬浮剂、50%咯菌腈可湿性粉剂和50%腐霉利可湿性粉剂。按照药剂田间最高推荐浓度,将上述4种杀菌剂分别稀释至0.25、0.5、0.1、0.625 mg·L-1,以清水为对照,共5个处理,各处理田间面积为20 m2,3次重复。2020年4月5日首次施药,之后每隔5 d施药1次,共喷施3次。施药前和最后一次施药后7 d,调查小区总株数、花蕾发病级数。七叶一枝花灰霉病分级标准、病情指数及防治效果统计参照魏晓兵等[13]的方法。病情分级标准如下：0级,未发病;1级,病斑面积占花蕾面积5%及以下;3级：病斑面积占花蕾面积6%～10%;5级：病斑面积占花蕾面积11%～20%;7级：病斑面积占花蕾面积21%～50%;9级：病斑面积占花蕾面积50%以上。其中,病情指数=[∑(各级病花数×各级代表值)/(调查总花数×最高级代表值)]×100;防治效果/%=[(对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区病情指数]×100。

1.3 统计与分析

用DPS 9.50和Excel 2010进行数据的统计分析和图表绘制,采用Duncan多重比较法进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 七叶一枝花灰霉病田间症状和菌株形态

灰霉病主要为害七叶一枝花顶端花,多先侵染残留的柱头或花瓣,呈灰白色,并生有厚厚的灰色霉层,呈水腐状;灰霉病侵染过的花不能座果(图1A)。菌落蓬松绒毛状,初始白色,后灰白色至鼠灰色,边缘不整齐,平铺(图1B)。

A.田间症状;B.菌落特征。图1 七叶一枝花灰霉病田间症状及菌落特征Figure 1 Field symptoms and colony morphology of grey mildew disease of P.polyphylla

2.2 杀菌剂对七叶一枝花灰霉病菌的室内毒力

由表1可知,供试的7种杀菌剂对七叶一枝花灰霉病菌均有一定毒力,且不同杀菌剂处理间EC50差异显著。其中,25%啶菌噁唑乳油、40%嘧霉胺悬浮剂、50%咯菌腈可湿性粉剂和50%腐霉利可湿性粉剂对灰霉菌菌丝的生长具有显著的抑制作用,EC50分别为0.042 2、0.052 6、0.017 2、0.124 9 mg·L-1,可选取这4种毒力较高的杀菌剂进行田间试验。10%苯醚甲环唑水分散剂对七叶一枝花灰霉病菌的毒力低于以上4种杀菌剂,43%戊唑醇悬浮剂的毒力最低。

表1 不同杀菌剂对七叶一枝花灰霉病菌的室内毒力比较

2.3 杀菌剂对七叶一枝花灰霉病菌的田间药效

由图2可知,施药后7 d对照区的七叶一枝花灰霉病病情指数最高,为45.93;0.625 g·L-150%腐霉利处理地块的病情指数次之,为16.18;0.25 g·L-125%啶菌噁唑和0.5 g·L-140%嘧霉胺处理地块的病情指数分别为9.48和10.69,显著低于对照和腐霉利处理地块;0.1 g·L-150%咯菌腈处理地块病情指数最低,为7.39。

不同小写字母表示各处理间差异达0.05显著水平。图2 七叶一枝花灰霉病病情指数比较Figure 2 Disease index of grey mildew disease of P.polyphylla treated with different fungicides

4种杀菌剂对七叶一枝花灰霉病菌的防治效果见图3。0.1 g·L-150%咯菌腈的防治效果最好,达83.90%,且显著高于其他处理;0.25 g·L-125%啶菌噁唑和0.5 g·L-140%嘧霉胺的防治效果次之,分别为79.40%和76.73%,但两者间差异不显著;0.625 g·L-150%腐霉利的防治效果最低,仅65.35%。

不同小写字母表示各处理间差异达0.05显著水平。图3 4种杀菌剂对七叶一枝花灰霉病菌的防治效果Figure 3 Field control efficacy of 4 fungicides on grey mildew disease of P.polyphylla

3 讨论

灰霉病菌繁殖快、遗传变异大,极易产生抗药性[14-15]。不同作用机制的农药混配或交替施用,可有效降低农药对单一靶标的刺激,减小抗性风险;通过混配产生的增效作用还可有效减少农药施用量,降低农药残留[16]。唐涛等[10]研究发现,氟啶胺、氟硅唑、咯菌腈和异菌脲可用于七叶一枝花灰霉病防治。本研究表明,25%啶菌噁唑乳油、40%嘧霉胺悬浮剂、50%咯菌腈可湿性粉剂、50%腐霉利可湿性粉剂对七叶一枝花灰霉病菌具有较高的毒力,EC50均低于1 mg·L-1,其中50%咯菌腈可湿性粉剂的毒力最高。已有研究表明,腐霉利、咯菌腈、啶菌噁唑、嘧霉胺等4种杀菌剂的作用机制不同[17-22],药效也存在一定差异。本研究田间试验表明,0.1 g·L-150%咯菌腈可湿性粉剂的防治效果最高,0.25 g·L-125%啶菌噁唑乳油和0.5 g·L-140%嘧霉胺悬浮剂次之,0.625 g·L-150%腐霉利可湿性粉剂的防治效果最低,这可能与腐霉利的广泛和高频次施用,导致七叶一枝花灰霉病菌的抗药性上升有关,具体抗性监测和抗性上升机制还有待深入研究。

综合来看,咯菌腈、啶菌噁唑和嘧霉胺对七叶一枝花灰霉病菌的防治效果较好,可考虑将3种杀菌剂交替施用或混配施用,以降低抗性风险和农药残留。发病前和发病初期及时喷施杀菌剂可有效降低七叶一枝花灰霉病的病情,提高防治效果。