HPLC测定樱桃咯菌腈的残留量研究

张雪丹，杨娟侠，辛 力，王明林，连玉晶，刘 涛

（1.山东省果树研究所，山东泰安 271000；2.山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安 271000；3.山东黄岛出入境检验检疫局，山东青岛 266000）

咯菌腈（Fludioxonil），化学名称4-（2,2-二氟-1,3-苯并间二氧-4-基吡咯-3-腈），商品名为Saphire，Celest或适乐时[1]。该产品是1984年由瑞士Ciba-Geigy公司（现先正达公司）开发的苯基吡咯类杀菌剂，对防治根腐病、青枯病、茎基腐病等疾病具有显著效果，可广泛应用于棉花、小麦、花生、大豆、水稻等多种作物种子的处理上[2-4]。咯菌腈作为一种新型的低毒低残留仿生杀菌剂，对果蔬采后贮藏保鲜过程中产生的绿霉、青霉、干腐病、灰霉菌等也有很好的防治效果，已有其在柑橘、苹果、马铃薯、草莓、葡萄、石榴等果蔬应用的品质保持和安全性检测等研究报道[5-10]。

分子结构见图1。

图1 分子结构

最大残留限量Maximum residue limits（MRL） 是某一种化学残留物在特定食品中合法的或可被接受的最高含量，单位是mg/kg，是食品安全检验的重要指标。美国、加拿大、澳大利亚、新西兰、欧盟等均允许将咯菌腈用于果蔬采后杀菌保鲜处理，但各方对最大残留限量MRL的规定不一。其中，美国、澳大利亚和新西兰规定核果类（桃、樱桃、杏等）MRL为5.0 mg/kg；加拿大规定菠萝MRL为20 mg/kg，柑橘类果实为10 mg/kg，西红柿为5 mg/kg；欧盟规定叶菜类MRL为20 mg/kg。目前，我国尚未准许咯菌腈用于果蔬采后杀菌保鲜，山东营养源食品科技有限公司已向农业部提交此方面的申请。

山东省果树研究所果品贮藏保鲜课题组自2016年以来一直开展咯菌腈对樱桃贮藏保鲜品质及安全性研究。研究发现，樱桃经咯菌腈处理后不仅可以大大降低果实贮藏期腐烂率，还在保持果实硬度和果梗色泽和降低果实凹陷率等方面具有良好的效果。但咯菌腈处理后的果实食用安全性是其应用的前提，咯菌腈残留量是评价其安全性能最重要的指标之一。因此，利用高效液相色谱法（HPLC） 测定不同处理的樱桃咯菌腈的残留量，为咯菌腈在果蔬贮藏保鲜应用方面提供理论依据。

1 试验条件与方法

1.1 试验原料

樱桃，品种为“红灯”，2016年5月和2017年5月采于山东省泰安市新泰区宫里樱桃园，八九成熟，去除病虫害、畸形果等。果实为现采果，运回实验室立即进行咯菌腈浸泡处理。

LC-20A型液相色谱仪，日本岛津公司产品。

乙腈（色谱级）、咯菌腈标准品（含量99.5%）、氯化钠（NaCl）和无水硫酸镁（MgSO4），均为分析纯；实验用咯菌腈（含量50.0%），由美国先正达公司生产提供。

1.2 色谱操作条件

色谱柱：C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：乙腈∶水（75∶25，V∶V），流速1.0 mL/min，柱温30℃，检测波长240 nm，进样体积20.0 μL。可根据不同的仪器适当调整操作参数，以获得最佳分析效果。

1.3 咯菌腈处理樱桃方法

1.3.1 果面水分对樱桃果实咯菌腈残留量的影响

取100个樱桃果，分别用含量为200 mg/kg的咯菌腈溶液浸泡20 s，然后装盒，或者用卫生纸将果面水分擦干后装盒，再用HPLC测咯菌腈残留量，每个处理做3个重复。

1.3.2 不同浸泡时间咯菌腈处理樱桃果实的残留量

取100个樱桃果，分别用含量为200 mg/kg的咯菌腈溶液浸泡不同时间（10，20，30，40，50，60 s）后装盒，用HPLC测咯菌腈残留量，每个处理做3个重复。

1.3.3 不同含量咯菌腈处理樱桃果实的残留量

取100个樱桃果，分别用不同含量（100，200，300 mg/kg） 的咯菌腈溶液浸泡20 s，然后吸干果面水分后装盒，用HPLC测咯菌腈残留量，每个处理做3个重复。

当腔长L为λ/8的奇数倍，即L=(2m+1)λ/8时干涉光强达到最大值；当腔长L为λ/8的偶数倍时，也即L=2mλ/8时干涉光强最小.这两种情况下的输出信号都是非线性的，系统的灵敏度最低.而在信号曲线斜率最大的位置，光强信号的线性最好，此时系统的灵敏度也最高.因此在采用F-P干涉检测微悬臂的偏移时，将参考点设置在信号线性斜率最大的位置，即图4中所示的Q点.将该点对应的F-P干涉仪腔长定义为参考点腔长，F-P干涉仪工作之前的腔长定义为初始腔长，微悬臂偏移时的腔长定义为工作腔长.

1.3.4 水冲洗对樱桃果实咯菌腈残留量的影响

取100个樱桃果，用含量为200 mg/kg的咯菌腈溶液浸泡20 s，然后用水冲洗5 min再吸干果面水分后装盒，测咯菌腈残留量，每个处理做3个重复。

2 试验步骤

2.1 标样溶液的配制

称取标样1.00 g（精确至0.000 1 g），置于100 mL容量瓶，加入乙腈超声波处理10 min，然后定容为100 mg/L的标样溶液。用0.45 μm滤膜过滤至玻璃LC小瓶中，进行HPLC分析。

标样溶液液相色谱见图2。

图2 标样溶液液相色谱

2.2 樱桃样品HPLC测定预处理

处理后的样品果去核，然后低温破碎，快速称取样品10.00 g于50 mL玻璃具塞离心管，加入10.00 mL乙腈，超声提取15 min，再加入1.00 g氯化钠和4.00 g无水硫酸镁（MgSO4），涡旋1 min，随后以转速4 000 r/min离心5.0 min；取1.00 mL上清液，同时加入100.00 mg MgSO4和10.00 mg石墨碳（GCB），涡旋30 s；上清液过0.45 μm滤膜至玻璃LC小瓶中，滤液进行HPLC分析。

2.3 样品测定

根据上述方式处理样品，待高效液相色谱仪平稳后按顺序进样检测。

2.4 计算与统计分析

咯菌腈标准溶液浓度为C标，HPLC所测得的咯菌腈标准溶液的峰面积为A标，HPLC所测得的试样溶液的咯菌腈峰面积为A样，则试样中咯菌腈的质量浓度C样（mg/L） 按下式计算：

式中：V样——标样溶液的体积，L；

m样——樱桃试样的质量，kg。

每个样品做3次重复，咯菌腈的残留量X均为3次重复试验结果平均值，以X±RSD（%）表示。

3 结果与分析

3.1 果面水分对樱桃果实咯菌腈残留量的影响

樱桃果实采后最好经低温水预冷处理以降低果实温度、减少果面附着的灰尘与病菌等，预冷水处理后的果面和果梗处有细微的残存水珠，生产上若是直接销售时是不对残存水珠做吸干处理的。试验樱桃经低温咯菌腈溶液浸泡处理后直接装盒测定，或者对果面水分进行吸干处理，以此来判断果面残存液对樱桃果实咯菌腈残留量的影响。测定发现，樱桃经低温咯菌腈溶液浸泡处理后直接装盒的果实咯菌腈残留量为1.997 mg/kg±6.94%，而经咯菌腈溶液浸泡处理后对果面水分进行吸干处理的果实咯菌腈残留量为0.161 mg/kg±0.22%，即经咯菌腈溶液浸泡后残存的果面水分对樱桃果实咯菌腈残留量影响很大，建议用咯菌腈溶液处理樱桃果实后进行水分吸干处理以降低咯菌腈残留量。但无论是否进行水分吸干处理，200 mg/kg的咯菌腈溶液浸泡20 s后樱桃果实咯菌腈残留量均低于5.00 mg/kg。

3.2 浸泡时间对樱桃果实咯菌腈残留量的影响

课题组研究发现，用100 mg/kg的咯菌腈溶液浸泡20 s处理樱桃果实就可以减少果实掉柄率、保持果实色泽、降低果实腐烂率和延长果实保鲜期。研究发现，增加咯菌腈溶液含量（100～600 mg/kg） 不会对樱桃果实产生伤害。试验用含量为200 mg/kg的咯菌腈溶液浸泡樱桃果实不同时间（10，20，30，40，50，60 s），以此研究浸泡时间对樱桃果实咯菌腈残留量的影响。

不同浸泡时间的樱桃果实咯菌腈残留量见表1。

表1 不同浸泡时间的樱桃果实咯菌腈残留量

由表1可知，随着咯菌腈溶液浸泡时间的延长，樱桃果实咯菌腈的残留量逐渐升高。在不擦干果面残留液的情况下，200 mg/kg的咯菌腈溶液浸泡60 s处理樱桃果实的咯菌腈的残留量为4.276 mg/kg±0.22%，低于5.00 mg/kg。因此，建议在保证咯菌腈杀菌及保持果实品质效果的情况下，樱桃果实在咯菌腈溶液中的浸泡时间越短越好。

3.3 不同含量咯菌腈处理樱桃果实的残留量

通过检测100，200，300 mg/kg的咯菌腈溶液浸泡20 s后果实的咯菌腈残留量，用以确定咯菌腈溶液含量对樱桃咯菌腈残留量的影响。研究发现，100 mg/kg咯菌腈溶液浸泡20 s后果实的咯菌腈残留量为0.161 9±4.72%，200 mg/kg咯菌腈溶液处理的咯菌腈残留量为0.161 mg/kg±0.22%，300 mg/kg咯菌腈溶液处理的咯菌腈残留量为0.169 mg/kg±8.84%。由此可知，进行水分吸干处理的前提下，不同含量的咯菌腈溶液（100～300 mg/kg） 浸泡处理樱桃20 s后果实的咯菌腈残留量几乎相同，即咯菌腈含量对短时浸泡樱桃果实的咯菌腈残留量的影响较少。

3.4 水冲洗对樱桃果实咯菌腈残留量的影响

咯菌腈溶液短时浸泡即可杀灭附着在樱桃果面的病菌，为了尽可能少地降低果实咯菌腈残留量，测定了樱桃经咯菌腈溶液浸泡后在自来水中冲洗5 min后的咯菌腈残留量，研究水冲洗对咯菌腈残留量的影响。结果表明，樱桃果实经含量为200 mg/kg的咯菌腈溶液浸泡20 s后用水冲洗5 min再吸干果面水分后的咯菌腈残留量为0.003 1 mg/kg±16.64%，而未经水冲洗的樱桃咯菌腈残留量为0.161 mg/kg±0.22%，即樱桃经咯菌腈溶液浸泡后再用水冲洗可大大降低樱桃果实咯菌腈的残留量。结合生产实际，建议樱桃果实采后预冷分级时先用咯菌腈溶液短时浸泡处理降低樱桃果面的病菌和灰尘，再用预冷水冲洗樱桃以降低果温和果实表面残存的咯菌腈。

4 结论

试验建立了利用HPLC检测樱桃咯菌腈的残留量分析方法，研究了咯菌腈溶液浸泡樱桃时果面水分、浸泡时间、溶液浓度及浸泡后水冲洗处理对樱桃果实咯菌腈残留量的影响。结果表明，咯菌腈溶液处理樱桃果实后吸干果面水分处理可大大降低咯菌腈残留量；随着咯菌腈溶液浸泡时间的延长，咯菌腈残留量逐渐升高，但咯菌腈浓度对短时浸泡樱桃的咯菌腈残留量影响较少。同时，咯菌腈溶液处理后再用水冲洗樱桃也可降低果实咯菌腈的残留量。所有检测结果表明，樱桃经咯菌腈处理后的残存量很低，均未超过国外果蔬关于咯菌腈最大残留量的标准，可以安全食用。