奥卡西平对三叉神经痛大鼠BDNF/Nrf2通路及机械痛敏的影响

田佳玉 冯丹 胡焓 张书力 袁峰 (武汉市第一医院疼痛科，湖北 武汉 430000)

三叉神经痛(TN)主要病因是三叉神经周围出现微血管压迫，尽管最初的损伤已经愈合，但疼痛倾向持续存在，可严重影响患者的身心健康〔1〕。脑源性神经营养因子(BDNF)影响神经元的存活、分化、生长发育，其含量的多少与疼痛感的传递密切相关〔2〕。另外，神经性疼痛可诱导氧化应激的产生，而因子E2相关因子(Nrf2)信号通路是目前发现的与外源性刺激和氧化应激相关的主要途径，血红素氧合酶(HO)-1为其下游因子〔3〕，Nrf2信号通路激活可进一步抑制机械性痛觉敏感、机械异位痛和热性痛觉过敏〔4〕。奥卡西平(OXC)主要用于局部性和全身性癫痫发作，可有效治疗病毒性脑炎继发癫痫，降低患者体内炎性因子水平，调节患者的免疫功能紊乱和机体氧化应激状态〔5〕。但是OXC对TN大鼠BDNF/Nrf2通路及机械痛敏的影响，目前尚未有研究。本研究旨在探究OXC对TN大鼠BDNF/Nrf2通路及机械痛敏的影响并初步探究其机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 SPF级SD大鼠(60只，雄性，体重200～220 g，6～8周龄)，动物许可证号：SCXK(豫)2017-0001，购自河南省实验动物中心。本研究通过医院动物伦理委员会批准并根据3R原则对待实验动物。

1.1.2实验药物 OXC，规格：0.15 g×50片，批准文号：国药准字J20171081和卡马西平(CBZ)，规格：0.2 g×30片，批准文号：国药准字H102279均购自北京诺华制药有限公司。

1.1.3主要试剂和仪器 炎性因子酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海酶联生物公司)；苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(索莱宝公司)；BDNF、Nrf2、HO-1兔抗和辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG二抗(Abcam公司)；电子测痛仪(Electric Von Frey型，仪数科技公司)；酶标仪(Fax-20100型，INStat公司)；光学显微镜(SMZ745型，普赫公司)；全能型凝胶成像分析系统(ChemiDoc-MP型，湖北惠达公司)；等。

1.2方法

1.2.1TN大鼠模型的建立及分组 采用改良后的大鼠眶下神经慢性压迫性损伤法建立大鼠TN模型〔6〕：术前需禁食12 h，自由饮水。腹腔注射戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉大鼠后，取右侧卧位，固定头部及四肢于手术台上，剔除右侧面部触须及毛发、酒精擦拭皮肤。在手术显微镜下，使用手术刀沿大鼠眶下缘3～4 mm处，紧贴鼻根，并沿鼻骨方向切3～5 cm长切口，充分暴露出右侧眼眶，分离出位于眶底部内侧的眶下神经(共两道，相隔约1 mm)，用两根4-0烙制羊肠线轻轻结扎眶下神经(假手术组仅暴露神经，不结扎，其他步骤与造模大鼠相同)，结扎标准：显微镜下可见结扎线使神经稍微变细，并不完全阻断传导，且不影响神经外膜血液循环。结扎完成后，缝合创口，待动物清醒后正常饲喂。实验共分为假手术组、模型组、OXC低、中、高(50、100、200 mg/kg〔7〕)剂量组、CBZ组(阳性对照，7.5 mg/kg〔8〕)各10只，各组灌胃相应剂量药物，1次/d，连续7 d。

1.2.2机械测痛仪检测机械痛阈值 实验前1 w对大鼠进行机械刺激适应性训练：围绕鼻区中央的触须部位及周围皮肤，用细丝刺激大鼠眶下神经。分别在建模前3、1 d，建模后1、3、5、7 d用电子测痛仪在大鼠鼻区中央的触须部位及周围皮肤行机械痛阈值测定，测试时间为上午10～12点，测定温度保持22℃左右。每只大鼠每次刺激6次，每次间隔1 min。电子测痛仪可将刺激压力传导BME-Tactile软件中，并自动计算出相应的机械痛阈值(共刺激6次，每次间隔1 min)。记录大鼠阳性反应(即以下行为出现一种时)：①退缩，大鼠快速闪躲、后退、转身、蜷缩身子、靠拢笼壁、将面部覆于身下；②攻击，大鼠抓咬刺激物；③骚抓，大鼠至少3次骚抓刺激部。记录有效机械痛阈值，即大鼠产生阳性反应强度的最小值。

1.2.3HE染色观察三叉神经组织病理变化 上述1.2.2实验结束后，对大鼠实施安乐死，尾静脉取血(4℃、13 000 r/min离心15 min)，血清置于-20℃冰箱中用于后续ELISA检测。按照上述1.2.1手术步骤，各组随机取3只大鼠三叉神经组织置于4%多聚甲醛中固定(另外7只置于-80℃冰箱用于后续检测)，经脱水后、石蜡包埋、切片机切片(5 μm厚)后，进行染色，置于光学显微镜下观察。

1.2.4ELISA法检测炎性因子含量 取上述1.2.3中-20℃冰箱中保存的各组大鼠血清，严格ELISA试剂盒说明书检测按照白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α和IL-1β含量。

1.2.5生物化学法检测三叉神经组织中含胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量 取上述1.2.3中-80℃保存的各组部分三叉神经组织，参照李海军等〔9〕方法制备组织匀浆(0.5 g三叉神经组织加入0.9% NaCl溶液匀浆)，4 000 r/min离心10 min，取上清，比色法检测GSH-Px活性，硫代巴比妥酸法检测SOD活性，黄嘌呤氧化法检测MDA含量。

1.2.6Western印迹检测三叉神经组织中BDNF、Nrf2和HO-1蛋白表达水平 取上述1.2.3中-80℃保存的各组剩余三叉神经组织，提取总蛋白，对蛋白定量，取50 μg蛋白样品进行电泳、转聚偏氟乙烯(PVDF)膜、封闭、BDNF、Nrf2和HO-1兔抗(稀释比1∶1 000)4 ℃过夜孵育、二抗(1∶2 000)室温孵育2 h，显色，以β-actin为内参，分析蛋白表达水平。

1.3统计学方法 采用SPSS22.0软件进行方差分析及SNK-Q检验。

2 结 果

2.1OXC对不同时间点机械痛阈值的影响 建模前3、1 d，各组机械痛阈值差异不显著(P>0.05)。建模后1、3 d，与假手术组相比，模型组机械痛阈值显著降低(P<0.05)，与模型组相比，OXC低中高剂量组和CBZ组机械痛阈值差异不显著(P>0.05)。建模后5、7 d，模型组机械痛阈值显著低于假手术组(P<0.05)；OXC低、中、高剂量组机械痛阈值较模型组依次明显升高，OXC高剂量组和CBZ组机械痛阈值差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组机械痛阈值比较

2.2OXC对TN大鼠三叉神经组织病理变化的影响 假手术组三叉神经组织结构正常，无明显病理性变化；模型组三叉神经组织结构紊乱，间质异常，出现大量炎性因子浸润；与模型组相比，OXC低、中、高剂量组三叉神经组织上述病理损伤依次减轻；OXC高剂量组和CBZ组三叉神经组织病理性损伤差异不明显。见图1。

图1 各组三叉神经组织病理学变化(HE染色，×200)

2.3OXC对TN三叉神经组织GSH-Px、SOD活性和MDA含量的影响 与假手术组相比，模型组三叉神经组织中GSH-Px、SOD活性显著降低，MDA含量显著升高(P<0.05)；与模型组相比，OXC低、中、高剂量组三叉神经组织中GSH-Px、SOD活性依次升高，MDA含量依次降低(P<0.05)；OXC高剂量组、CBE组三叉神经组织中GSH-Px、SOD活性和MDA含量差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.4OXC对TN大鼠三叉神经组织BDNF、Nrf2和HO-1蛋白表达水平的影响 与假手术组相比，模型组三叉神经组织BDNF、Nrf2和HO-1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；OXC低、中、高剂量组三叉神经组织BDNF、Nrf2和HO-1蛋白表达水平较模型组依次明显升高(P<0.05)；OXC高剂量组、CBE组三叉神经组织BDNF、Nrf2和HO-1蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表2和图2。

表2 各组三叉神经组织GSH-Px、SOD活性和MDA含量及BDNF、Nrf2和HO-1蛋白表达水平比较

1～6：假手术组，模型组，OXC低剂量组，OXC中剂量组，OXC高剂量组，CBZ组图2 Western印迹检测各组三叉神经组织中BDNF、Nrf2和HO-1蛋白表达

2.5OXC对TN大鼠血清中炎性因子含量的影响 与假手术组相比，模型组血清炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量显著升高(P<0.05)；OXC低、中、高剂量组、CBE组血清TNF-α、IL-6和IL-1β含量较模型组依次明显降低(P<0.05)；OXC高剂量组、CBE组血清炎性因子含量差异不显著(P>0.05)。见表3。

表3 各组血清炎性因子含量比较

3 讨 论

TN属于慢性继发性疼痛，主要由周围或中枢神经系统损伤或疾病引起，没有高度的专业化治疗手段且诊断和治疗均较为困难，涉及麻醉科、神经科、牙科、神经外科等多门学科〔10〕。目前已有多种药物可用于治疗，包括加巴喷丁、普雷加巴林、三环抗抑郁药等，但是其副作用限制了现有药物治疗的使用〔11〕，手术治疗可显著改善疼痛症状，但是操作极为严格且费用昂贵〔12〕。本研究提示模型构建成功，产生炎症反应且大鼠疼痛敏感性增加。

OXC主要治疗癫痫病患者，尤其是对于强直阵挛性发作的或者部分性癫痫的患者，另外，OXC也可以治疗神经性头痛，比如带状疱疹后神经痛及周围神经病变导致的肢体麻木症状，此药副作用相对较小。孟伟建等〔13〕研究发现中药汤剂联合OXC混悬液治疗癫痫，可有效地降低机体炎症反应，减少癫痫发作频率，临床疗效显著且安全性高。另外，OXC治疗，对缺血性损伤后的脑损伤具有神经保护作用，这种神经保护作用可能通过氧化应激和神经炎症的减弱表现出来〔14〕。其中GSH-Px、SOD可作为抗氧化应激能力强弱的指标，MDA可作为评定氧化应激反应严重程度的指标，而TNF-α、IL-6和IL-1β水平与炎性反应密切相关，水平越高表明炎症越严重。另外，Szok等〔15〕研究发现OXC可用于治疗TN。本研究结果提示OXC可降低TN大鼠氧化应激及炎症反应，降低大鼠疼痛敏感性，但其中的机制尚需进一步研究。

Zhang等〔16〕研究发现，眼镜蛇毒素可能通过下调BDNF通路，引起大鼠TN和认知功能障碍，而双相躁狂患者血清BDNF水平较低，OXC短期单药治疗后BDNF水平升高〔17〕。罗杰等〔18〕研究发现逍遥散可能通过激活Nrf2通路，上调BDNF水平，从而改善氧化应激状态，抵抗嗅球摘除大鼠抑郁症。Yoo等〔19〕研究发现乙酰复合胺可通过激活神经元细胞中BDNF和Nrf2通路，对神经起保护作用，改善氧化应激及细胞凋亡。通过激活BDNF/Nrf2信号通路可减轻慢性压迫性神经损伤大鼠的神经性疼痛〔20〕。提示OXC可能通过激活BDNF/Nrf2通路，减轻氧化应激反应，实现降低大鼠疼痛敏感性的功能。

综上，OXC可能通过激活TN大鼠BDNF/Nrf2通路，减轻氧化应激及炎症反应，降低大鼠机械疼痛敏感性。但是TN的机制比较复杂，可能涉及其他通路，因此，OXZ对TN治疗机制尚需深入研究。