MMP-9、Myosin-9及LGR4在老年非小细胞肺癌中表达及临床意义

王宝 赵晖 贾春祎 赵鑫 邹勤光 孙少林 王启文 (吉林省肿瘤医院，吉林 长春 130000)

肺癌是临床中最为常见的恶性肿瘤，目前在已知的恶性肿瘤中，发病率和死亡率均居首位，每年全球超过90万人因该病死亡，已成为严重的公共健康问题〔1〕。肺癌本身具有侵袭、转移能力强的特点，在疾病早期易发生转移，大部分肺癌患者就诊时多已发生区域淋巴结转移〔2〕。随着现代分子生物学的发展，肺癌发病机制已成为研究热点，但该病发病机制复杂，至今未能完全阐明其发病的深层机制〔3,4〕。非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌发生的大多数，小细胞肺癌患者手术疗效不佳，故本研究选取NSCLC患者为研究对象。基质金属蛋白酶(MMP)-9可促进肿瘤内新生血管的形成，为肿瘤组织供给血液，对肿瘤细胞的侵袭、转移起到促进作用〔5〕。肌球蛋白重链(Myosin)-9是非肌肉肌球蛋白家族一员，其与细胞的多重生物学功能有关，是新发现的肿瘤转移相关蛋白，Myosin-9对NSCLC临床病理学影响并未见系统研究〔6〕。富含亮氨酸重复序列G耦联蛋白受体(LGR)4，属于哺乳类基因中最大的蛋白超家族，原癌基因Wnt异常时，可增加LGR4蛋白表达，加速肿瘤细胞分裂、增殖〔7〕。本研究探讨MMP-9、Myosin-9及LGR4在老年NSCLC中表达及临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择吉林省肿瘤医院于2019年3月至2021年3月进行手术的老年NSCLC患者53例，平均(71.87±5.46)岁；纳入标准：均经手术病理证实为NSCLC患者；年龄≥60岁；未进行化疗、放疗及激素治疗者。排除标准：具有明显炎症细胞浸润癌旁组织；合并其他肿瘤者。

1.2试剂与仪器 主要试剂：兔抗人MMP-9、兔抗人Myosin-9、兔抗人LGR4(北京百奥莱博科技有限公司)；二氨基联苯胺(DAB)试剂盒(武汉博士德公司)，SP法组化试剂盒(福州迈新生物技术有限公司)，Trizol试剂盒(碧云天生物技术公司)，逆转录试剂盒(碧云天生物技术公司)，二喹啉甲酸(BCA)试剂盒(上海雅吉生物科技有限公司)。主要仪器：光学显微镜(日本Olympus)，移液枪(美国Thermo)，石蜡切片机(美国Thermo)，PCR仪(力康生物医疗科技控股有限公司)，电泳仪(北京六一仪器厂)。

1.3取样 将入组患者术中切除肿瘤组织部分进行取样，一部分送往病理科进行病理观察及免疫组化染色；另一部分液氮保存用于MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白及mRNA检测。另取入组患者经病理证实为癌旁5 cm以上的肺组织作为对照。

1.4免疫组化法测定MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白 取所有标本以10%多聚甲醛液固定，采用石蜡包埋，以4 μm厚连续切片。石蜡切片，应用二甲苯常规脱蜡，并采用酒精复水，蒸馏水冲洗；应用苏木素染色5 min，应用自来水冲洗5 min；返蓝15 min；再以蒸馏水冲洗，伊红染液染色3 min；应用自来水冲洗，镜下观察。石蜡切片经烤箱烤片、常规二甲苯脱蜡，并采用不同梯度酒精水化；应用3%H2O2室温修复10 min，再以磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，2 min/次；微波抗原修复，应用PBS冲洗3 min；加入一抗放置于4℃孵育过夜，放于室温条件下，应用PBS冲洗3次，2 min/次；应用DAB显色5～10 min；脱水、透明和封片。结果判定：MMP-9、Myosin-9和LGR4主要定位于细胞膜或细胞质内。选取5个视野置于显微镜下观察，按阳性细胞数量和显色强度分级。其中以无着色为阴性(-)，以阳性细胞数25%并显色强度为淡黄色为弱阳性(+)，以阳性细胞数25%～60%并颜色强度介于强阳性与弱阳性之间为中度阳性()，以阳性细胞数〉60%并多数细胞呈棕褐色或棕黄色为强阳性()。

1.5实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)测定MMP-9、Myosin-9和LGR4表达 采用Trizol法提取癌组织及癌旁组织总RNA，RNA浓度和纯度采用分光光度计测定，以逆转录试剂盒反转录成cDNA。以cDNA作为模板，分别扩增MMP-9基因、Myosin-9基因、LGR4基因和GAPDH。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司。PCR条件：94℃预变形5 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环，72℃延伸7 min，设置3个复孔。应用2-△△Ct计算MMP-9、Myosin-9和LGR4相对表达量。

1.6Western印迹测定MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白表达 采用RIPA裂解液提取癌组织及癌旁组织蛋白，根据BCA法测定蛋白浓度，加入缓冲液后变性蛋白。按每泳道以50 μg蛋白12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，再采用5%脱脂奶粉37℃封闭1 h。加入MMP-9一抗(1∶500)、Myosin-9一抗(1∶200)和LGR4一抗(1∶500)后放置于4℃孵育过夜。应用TBST溶液漂洗3次后，再加入二抗，室温孵育1 h。再采用TBST洗涤3次，10 min/次。应用电化学发光(ECL)液暗室发光显影，采集图像并分析，内参选GAPDH。

1.7统计学方法 采用SPSS26.0软件进行t检验、χ2检验，运用Logistic多因素回归分析NSCLC发病影响因素。

2 结 果

2.1癌组织与癌旁组织 MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白阳性率及mRNA表达比较 癌组织MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白阳性率、mRNA表达及蛋白灰度值明显高于癌旁组织(P<0.05)。见图1、表1。

表1 癌组织及癌旁组织MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白阳性率、mRNA表达及蛋白灰度值比较

图1 MMP-9、Myosin-9及LGR4蛋白在癌组织与癌旁组织中表达

2.2不同病理特征癌组织MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白阳性率及mRNA表达比较 不同性别、年龄、肿瘤类型和分化程度癌组织MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白阳性率及mRNA表达明显比较无明显差异(P>0.05)；Ⅲ期癌组织MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白阳性率及mRNA表达明显高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)；淋巴结转移癌组织MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白阳性率及mRNA表达明显高于无淋巴结转移组织(P<0.05)；吸烟史癌组织MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白阳性率及mRNA表达明显高于无吸烟史(P<0.05)。见表2。

表2 不同病理特征癌组织MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白阳性率及mRNA表达比较〔n(%)〕

2.3不同病理特征癌组织MMP-9、Myosin-9及LGR4蛋白表达比较 不同性别、年龄、肿瘤类型和分化程度癌组织MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白灰度值比较无明显差异(P>0.05)；Ⅲ期癌组织MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白灰度值明显高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)；淋巴结转移癌组织MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白灰度值明显高于无淋巴结转移组织(P<0.05)；吸烟史癌组织MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白灰度值明显高于无吸烟史组织(P<0.05)。见表3。

表3 不同病理特征癌组织MMP-9、Myosin-9和LGR4蛋白灰度值比较

2.4多因素Logistic回归分析老年NSCLC发病危险因素 吸烟史、MMP-9、Myosin-9和LGR4高表达为影响老年NSCLC发病危险因素。见表4。

表4 多因素Logistic回归分析老年NSCLC发病危险因素

3 讨 论

目前，关于NSCLC具体发病原因尚未完全明确，认为大气污染、吸烟、室内燃煤、石棉暴露、高浓度砷等均可增加肺癌风险〔8～10〕。由于NSCLC症状较为隐匿，通常就诊时已属中晚期，以此导致患者错失了最佳根治时机〔11〕。因此，及时有效地诊断和治疗NSCLC方法对提高疗效及预后具有重要意义。

MMPs是细胞外基质的重要调控因子，并且参与了肿瘤细胞外间质的分解，以此促进肿瘤的侵袭，而在肿瘤反复中侵袭性被认为是重要因素。MMP-9是MMPs家族中重要一员，是降解肿瘤细胞外基质的一种酶类，其成分主要为Ⅳ型胶原，而其中细胞外基质的降解是微淋巴管生成、肿瘤微血管生成及肿瘤侵袭转移的必要条件。多项研究证实，MMP-9在多种恶性肿瘤中高表达，并参与了肿瘤细胞的转移与侵袭，通过抑制MMP-9表达，从而达到抑制肿瘤生长并转移的目的〔12，13〕。彭炜东等〔14〕研究发现，MMP-9主要表达于肿瘤细胞，MMP-9表达与肺腺癌分化程度呈负相关，且与4年无进展生存期呈负相关。本研究表明，MMP-9在老年NSCLC患者中高表达；且MMP-9表达与临床分期、淋巴结转移和吸烟史密切相关。

Myosin-9是非肌肉肌球蛋白家族一员，并且作为参与细胞运动和迁移、细胞骨架重建的核心成员，其作用在肿瘤中越来越受人们关注〔15〕。Myosin-9主要由2条调节轻链、2条必需轻链和2条重链组成的一种留聚体，在炎症、血栓性疾病及遗传性疾病方面发挥作用。近年来研究发现，Myosin-9在多种恶性肿瘤中高表达，可见Myosin-9与人类各种疾病发生具有一定关系，并且认为可能与某种肿瘤发生、发展具有促进作用〔16，17〕。本研究表明，Myosin-9在老年NSCLC患者中高表达；且Myosin-9表达与临床分期、淋巴结转移和吸烟史密切相关。

LGR4是G蛋白耦联受体家族成员之一，称为富含亮氨酸重复序列的GPCR4，并且为重要的一种细胞膜受体，其组成包含17个内含子和18个外显子，在成人和胚胎各种组织中广泛表达，具有多种生物学功能，如促进器官发育、介导细胞信号传导与激活，在多种恶性肿瘤发生发展中发挥促癌作用〔18，19〕。王春梅等〔20〕研究发现，胃癌患者血清LGR4表达高于胃良性肿瘤患者，低～中分化LGR4表达高于高分化，Ⅲ期LGR4表达高于Ⅰ～Ⅱ期，淋巴结转移患者LGR4表达高于无淋巴结转移患者。本研究表明，LGR4在老年NSCLC患者中高表达；且LGR4表达与临床分期、淋巴结转移和吸烟史密切相关。

综上，MMP-9、Myosin-9和LGR4在老年NSCLC中表达，与临床分期、淋巴结转移和吸烟史密切相关，且为影响老年NSCLC发病危险因素。