反式和顺式二苯乙烯苷在大鼠体内的药代动力学比较研究*

柴士伟，高建，厍立鹤，于俏，庞旭，韩立峰

（1．天津中医药大学第一附属医院，天津 300193；2．国家中医针灸临床医学研究中心，天津 300193；3．天津市中药化学与分析重点实验室，天津 301617）

何首乌为蓼科植物何首乌（Polygonum multiflorum Thunb．）的干燥块根，味苦，归肝、心和肾经[1]。现代研究表明，2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（二苯乙烯苷，TSG）是何首乌的主要活性成分[2]，中国药典在2000年将其作为何首乌的定量指标，一直沿用至今[3]。现代药理研究发现：该化合物具有抗炎[4-5]、抗衰老[6]、抗氧化[7]、抗动脉粥样硬化[8]、保肝[9-10]和抗肿瘤[11]等多种生物活性。由结构可知，TSG具有反式和顺式两种构型[12]，反式二苯乙烯苷（trans-TSG）可以在光异构的作用下转变为顺式二苯乙烯苷（cis-TSG）。有文献报道cis-TSG可能是何首乌造成肝损伤的潜在毒性成分[13]，而trans-TSG目前为止未见任何肝毒性报道。由于trans-/cis-TSG的结构可以相互转变，而体内安全性差异显著，因此它们是否会表现出不同的体内药代动力学行为，值得进一步研究。前期已有文献报道trans-/cis-TSG的药代动力学参数，但主要是以中药制剂和提取物为主[14-15]，而这些制剂中的其他成分可能会对trans-/cis-TSG的体内药代动力学行为产生影响。因此，本实验以trans-/cis-TSG单体化合物为研究对象，建立了超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）分析方法，考察了单次给药后，trans-/cis-TSG在大鼠体内的药代动力学行为，为后续何首乌致肝损伤物质基础及作用机制研究提供参考依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 12只雄性SD大鼠（200±20）g，购自北京维通利华生物科技股份有限公司，实验动物许可证号为SCXK（京）2016-0011，实验已通过天津中医药大学伦理委员会批准，伦理审批编号为TCM-LAEC2021151。

1.2 药品与试剂 trans-TSG（纯度，HPLC面积归一化法：99．13%），cis-TSG（纯度，HPLC 面积归一化法：100%）为实验室自制，虎杖苷（上海源叶生物科技有限公司，ZM0530LA14，HPLC≥98%）。色谱乙腈、色谱甲醇（Thermo Fisher Scientific，美国），色谱甲酸（Anaqua Chemicals Supply，美国）。

1.3 仪器 Acquity H-Class UPLC超高效液相色谱系统和Xevo TQ-S质谱系统联用仪（Waters，美国）；KQ-1000DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；XW-80A型涡旋混合器（上海沪西分析仪器厂）；微量移液器（Eppendorf，德国）；Centrifuge冷冻台式高速离心机（Eppendorf，德国）；BP121S型天平（Sartorius，德国）；Millipore纯水器（Millipore，美国）。

2 实验方法

2.1 色谱条件 色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18Column（2．1 mm×50 mm，1．7 μm，Waters，美国）。乙腈（A）和 0．1%甲酸水（B）作为流动相，梯度洗脱，0～8 min，5%～45%B。柱温设置为30℃，进样体积为3 μL，流速为 0．3 mL/min。

2.2 质谱条件 负离子模式下，仪器方法的毛细管电压、锥孔电压和去溶剂化温度分别设置为2．5 kV，30 V和650℃；氮气作为去溶剂气体，流速设置为800 L/h；多反应监测（MRM）模式和其他关键参数设置如表1所示，基于Masslynx 4．1和TargetLynx软件，同时采集和分析大鼠血浆中trans-TSG和cis-TSG的定量信息。

表1 目标化合物的MRM参数Tab.1 MRM parameters of the target compounds

2.3 动物分组和给药 12只大鼠随机分为两组，trans-TSG组和cis-TSG组，每组6只。严格按照天津中医药大学动物中心管理规范饲养，在室温（20±5）℃，相对湿度55%～65%，通风良好，环境安静，定期消毒的环境下适应性饲养一周，期间自由饮水和饮食。分别单次给药60 mg/kg的trans-TSG和cis-TSG[16]，在给药后按照时间点：0，0．033，0．083，0．17，0．25，0．33，0．5，1，2，4，8，10，24 h，眼眶内眦取血，取至预先加入 10 μL肝素钠（100单位）的 1．5 mL离心管中，4 ℃离心 10 min（6 600×g），取上层血浆于-80℃冰箱冷冻保存。

2.4 血浆样本的处理 取出-80℃冰箱冷冻保存的大鼠血浆样品各100 μL，于4℃环境下解冻，分别加入600 μL冰甲醇和10 μL的内标溶液，涡旋震荡5 min，4 ℃下离心 20 min（13 200×g），取出上清，氮吹干。加入100 μL 50%的甲醇水溶液复溶，涡旋震荡 5 min，4 ℃下离心 20 min（13 200×g），取出上清，待测。

2.5 对照品溶液的配制 精确称量trans-TSG、cis-TSG和虎杖苷（内标）各1 mg分别溶解于1 mL的甲醇溶液中得1 mg/mL的溶液，然后用甲醇分别进行稀释得10 μg/mL的trans-TSG、cis-TSG和虎杖苷储备液。

2.6 统计学方法 trans-TSG、cis-TSG的药代动力学参数使用DAS药代动力学软件（版本1．0，中国药理学会，中国）进行计算。将数据导入graphpad prism 8．0进行分析，计算结果使用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，相关分析采用线性相关与回归分析，P＜0．05为差异有统计学意义。

2.7 方法学考察

2.7.1 专属性 按照“1．2．4血浆样本的处理”项下的实验方法对空白血浆（A）、空白血浆加入对照品溶液及内标溶液（B）和血浆样品加入内标溶液（C）进行分析。分别得到空白血浆色谱图、血浆对照品色谱图和血浆样品色谱图。

2.7.2 线性关系 精密吸取适量浓度为10 μg/mL的trans-TSG、cis-TSG储备液，加入适量甲醇，cis-TSG 分别稀释为 3．90，7．81，15．62，31．25，62．5，125，250，500，1 000和2 000 ng/mL一系列对照品溶液；trans-TSG 稀释浓度为 1．95，3．90，7．81，15．62，31．25，62．5，125，250，500 和 1 000 ng/mL 一系列对照品溶液。分别吸取上述对照品溶液100 μL，氮气吹干溶剂，加入 100 μL 空白血浆，按“1．2．4 血浆样本的处理”项下操作，然后进样分析。纵坐标表示标准品峰面积与内标峰峰面积比值，横坐标表示标准品浓度，绘制回归曲线，计算得线性回归方程。

2.7.3 日内和日间精密度 各取空白血浆100 μL按照“1．2．4 血浆样本的处理”项下的制备方法，配制“表3”中低、中、高3个浓度水平的混合标准品血浆样品。日内精密度即测定低、中、高3个浓度水平的混合标准品血浆样品，水平重复6次。日间精密度即连续3 d测定“日内精密度的样品”，根据随行标准曲线来确定浓度。计算相对标准偏差（RSD），并用测定浓度和已知浓度的百分比来评价准确度。

2.7.4 提取回收率和基质效应 配制低、中、高质量浓度的 trans-TSG（10、100和 1600 ng/mL）和 cis-TSG（5、50 和 800 ng/mL）的标准溶液，各取 100 μL，平行6份，分别加入10 μL内标溶液和100 μL空白血浆，样品预处理后测定，所得峰面积结果记为A；另取同样份数的空白血浆，加入10 μL内标溶液，经样品前处理后测定，所得峰面积结果记为B；准备高、中、低3个浓度的标准溶液各100 μL，平行6份，分别加入10 μL内标溶液，氮吹干后，用100 μL 50%甲醇复溶，所得峰面积结果记为C。A/B×100%为提取回收率，A/C×100%为基质效应。

2.7.5 稳定性 按照“1.2.4血浆样本的处理”项下制备方法，制备的低、中、高3个浓度水平的标准品血浆样品，分别考察其稳定性。稳定性评价包括样品盘内24 h稳定性、3次冻融循环稳定性。

3 结果

3.1 方法学验证

3.1.1 专属性 空白血浆色谱图（A），血浆对照品色谱图（B），血浆样品色谱图（C），如图1所示，结果表明样品色谱峰不受溶剂和内标的干扰，专属性良好。

图1 MRM模式下大鼠血浆中目标化合物的专属性色谱图Fig.1 Specificity chromatogram of the target compounds in rat plasma with the MRM mode

3.1.2 线性关系 目标分析化合物的线性回归方程、相关系数和线性范围如表2所示。结果表明，大鼠血浆中trans-TSG在3.90～2 000 ng/mL的范围内线性关系良好，cis-TSG在1.95～1 000 ng/mL的范围内线性关系良好。

表2 目标化合物的线性回归方程、相关系数和线性范围Tab.2 Linear regression equation，correlation coefficient and linear range of the target compounds

3.1.3 精密度和准确度 trans-TSG和cis-TSG的低、中、高3个浓度的日内精密度和日间精密度结果如表3所示，RSD值均小于12%，准确度在87.3～101.2，表明所建方法的精密度和准确度良好。

表3 目标化合物的精密度和准确度Tab.3 Precision and accuracy of the target compounds

3.1.4 提取回收率和基质效应 实验结果如表4所示，trans-TSG低、中、高3个浓度的平均回收率分别为91.7%、94.1%和92.2%；cis-TSG的低、中、高3个浓度的平均回收率分别为97.1%、90.1%和95.3%。两者的各个浓度的平均提取回收率均大于91%，且RSD均小于4.7%，表明trans-TSG和cis-TSG的回收率较高。

表4 提取回收率和基质效应Tab.4 Recovery and matrix effect

3.1.5 稳定性 trans-TSG和cis-TSG在样品盘放置24 h后以及3次冻融循环之后进行处理的状态下，低、中、高3个浓度的测定结果如图表5所示，显示出良好的稳定性。

表5 稳定性考察Tab.5 Study on the stability of the target compounds

3.2 血药浓度-时间曲线 如图2所示，大鼠单次灌胃60 mg/kg的trans-TSG和cis-TSG后，cis-TSG的血药浓度高于trans-TSG。

图2 trans-TSG和cis-TSG的血药浓度-时间曲线Fig.2 Plasma concentration time curves of trans-TSG and cis-TSG

3.3 药代动力学参数 trans-TSG和cis-TSG药代动力学参数使用DAS药代动力学软件进行计算，符合一室模型，分析所得的药-时曲线如图2所示，药代动力学参数如表6所示，单次给药trans-TSG和cis-TSG 后，cis-TSG 在大鼠体内的 AUC0-t、AUC0-∞和Tmax均大于trans-TSG，但无统计学差异。cis-TSG在大鼠体内的半衰期（T1/2）显著大于trans-TSG（P＜0．05）。而 trans-TSG 在大鼠体内的达峰浓度（Cmax）和清除率（CLz/F）则显著高于 cis-TSG（P＜0．05）。

表6 大鼠单次灌胃trans-TSG和cis-TSG的药代动力学参数（n=6）Tab.6 Pharmacokinetic parameters of trans-TSG and cis-TSG(n=6)

4 讨论

具有顺反结构的化合物，在一定条件下可以实现相互转化。顺反异构化过程及其机制，通常包括光异构化[17]、热致异构化[18]和催化异构化[19]。而何首乌中trans-TSG向cis-TSG的转化属于光致异构化。一般来说，对于热力学稳定的二苯乙烯类的反式结构，通过加热条件是难以实现构型转换，但在光照射下，反式异构体易转变为顺式异构体[20]。同时，二苯乙烯苷是多酚类化合物，意味着很容易发生氧化反应，因此二苯乙烯苷的降解除了可以通过光和热的条件而引发之外，氧气和碱性pH条件也应该格外注意[21]。因此，本研究在实验操作过程中全程避光，所配制的溶液也存放在低温避光环境，避免了trans-TSG和cis-TSG的相互转化。同时，由于trans-TSG和cis-TSG的质谱碎裂方式相同，因此，在提取离子流色谱图时，如果发生体内转化，将会同时出现trans-/cis-TSG的色谱峰，但在本研究中，未发现有转化现象（图1C）。

单次灌胃给药相同剂量的trans-TSG和cis-TSG后，cis-TSG在大鼠的AUC0-t大于trans-TSG，但未发现显著性差异（P＞0．05）。trans-TSG 在大鼠体内的 Cmax和 CLz/F 均显著高于 cis-TSG（P＜0．05），同时cis-TSG在大鼠体内的达峰时间（Tmax）和半衰期（T1/2）均大于trans-TSG，其中T1/2约为trans-TSG的4．4 倍，具有统计学差异（P＜0．05）。以上结果表明，cis-TSG在大鼠体内的暴露量高于trans-TSG，并且具有更低的清除率和较长的半衰期（P＜0．05），这表明cis-TSG在大鼠体内更容易出现蓄积，而有研究发现cis-TSG可能是何首乌中潜在的肝损伤风险成分[22]，这是否与cis-TSG在体内的蓄积有关，值得进一步的研究。

综上所述，本研究建立了UPLC-MS/MS分析方法，研究比较了何首乌中trans-TSG和cis-TSG在大鼠体内的药代动力学行为，为后续trans-/cis-TSG的进一步研究提供参考依据。