基于胰腺PI3K/AKT/BMAL1通路探讨针刺对2型糖尿病大鼠血糖昼夜节律的影响*

2023-01-31 11:57王栩张月刘汉东李洁赵文清周琼阳张智龙
天津中医药 2023年1期
关键词:生物钟节律胰岛

王栩,张月,刘汉东,李洁,赵文清,周琼阳,张智龙

(1.天津市中医药研究院附属医院针灸科,天津 300120;2.天津市红桥医院中医科,天津 300131;3.天津中医药大学研究生院,天津 301617)

糖尿病严重威胁着人类的健康,根据2019年国际糖尿病联盟发布的数据显示,至2045年将有1.472亿人患有糖尿病[1]。在2020年美国糖尿病学会颁布糖尿病医学诊疗标准中,新增了对2型糖尿病(T2DM)患者应用动态血糖谱报告评估血糖管理的推荐[2],由此说明血糖昼夜节律的调节对T2DM的治疗具有重要意义。血糖昼夜节律受胰岛生物钟节律的影响。目前,改善血糖昼夜节律的西药主要包括胰高血糖素样肽-1受体激动剂、磺脲类等,但上述药物存在诸多不良反应,如低血糖、胃肠道反应、皮疹等,影响药物的长期应用。血糖昼夜节律失衡而引起的持续高血糖可引起多种急慢性并发症,严重影响了患者的生活质量。

研究认为,脑和肌肉芳香烃受体核转位蛋白1(BMAL1)可调节胰岛生物钟的节律性,维持血糖昼夜节律[3]。其上游受磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)通路的调控,PI3K可磷酸化下游丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)的苏氨酸 308位点(pAkt T308)而激活AKT[4]。而AKT又可进一步激活BMAL1,从而调节血糖昼夜节律[5]。同时,针灸对T2DM具有治疗作用,1项系统评价表明单纯针刺和针刺配合降糖药均可降低T2DM患者空腹及餐后2 h血糖、糖化血红蛋白,且疗效优于假针刺及单纯使用降糖药[6]。笔者前期的临床及机制研究显示,调理脾胃针法可有效降低血糖;改善PI3K通路上下游关键蛋白表达及胰岛结构[7-9],但对PI3K/AKT/BMAL1介导针刺调节血糖昼夜节律的作用尚不明确。故本研究以高脂高糖结合小剂量腹腔注射链脲佐菌素(STZ)的T2DM大鼠为针刺效应平台,重点研究调理脾胃针法调节血糖昼夜节律失衡的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠36只,体质量(120±20)g,5周龄。购自斯贝福(北京)生物技术有限公司,动物许可证编号:SCXK(京)2019-0010。动物饲养于天津市中国医学科学院放射医学研究所,研究方案获研究所伦理委员会批准(No.IRM-DWLL-2020132),实验动物的处置符合2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 主要试剂及仪器 STZ(S0130,Sigma公司),大鼠胰岛素(INS)酶联免疫吸附法(ELISA)Kit(CSB-E05070r,武汉华美生物公司),PI3K、AKT、p-AKT、BMAL1 抗 体(ab183957,ab233755,ab38449,ab273648,英国Abcam公司),二抗(北京博奥森生物技术有限公司),ECLplus超敏发光液(PE0010,北京索莱宝公司),TUNEL试剂盒(Roche公司);中研太和针灸针(0.3 mm×13 mm),血糖仪及试纸(越佳型至新,雅培公司),酶标仪(美国Bio-Tek公司),凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司),脱水机及包埋机(武汉俊杰电子有限公司),病理切片机(上海徕卡仪器有限公司),荧光显微镜(OLYMPUS公司)。

1.3 模型建立 将大鼠适应性喂养1周后,采用高脂高糖饲料喂养2个月(高脂高糖饲料配方:蔗糖20%、猪油10%、蛋黄粉5%、胆固醇1%、猪胆汁酸钠0.1%、普通饲料63.9%)。后将造模大鼠禁食12 h,并按体质量一次性快速腹腔注射STZ溶液(以 0.1 mol枸橼酸盐缓冲液配制,pH=4.6),并按注射体积10 mL/kg,注射剂量25 mg/kg,STZ浓度2.5 mg/mL注射,30 min内使用完。于注射完成72 h后采用尾静脉取血方式,使用血糖仪测量血糖,以连续5 d随机血糖>16.7 mmol/L为T2DM造模成功[10]。动物成模后均予以普通饲料喂养。

1.4 动物分组及干预方法 采用随机数字表法将36只大鼠随机分为空白组10只与造模组26只,造模组按照上述造模方法造模,最终死亡6只,并将剩余的20只大鼠随机分为针刺组10只,模型组10只。针刺组取穴为:曲池、合谷、血海、足三里、丰隆、阴陵泉、地机、三阴交、太冲(以上穴位均取双侧),中脘,具体穴位定位参照李忠仁主编的《实验针灸学》[11]。具体操作:首先将大鼠置于自制大鼠针刺服中[8],以减少躁动。身着大鼠针刺服后,大鼠躁动基本消失,可同时多针刺、久留针,并可多只同时针刺操作,具有针刺可行性。而后穴位与针具常规消毒,选用中研太和0.3 mm×13 mm针灸针进行针刺,并于 23:30、05:30、11:30、17:30 进行针刺,每次留针30 min,每日治疗1次,每周治疗5次,共治疗4周。空白组及模型组不予干预。

1.5 检测指标

1.5.1 一般情况 对造模前后大鼠的精神状态、毛色、进食量、饮水量、尿量、便质进行观察。

1.5.2 4时相即时血糖检测 于干预前及针刺4周后,将各组大鼠禁食12 h,自由饮水。分别于0、6、12、18时采用尾静脉取血法,用血糖仪测量即时血糖。

1.5.3 平均血糖的标准差(SDBG)和最大血糖波动幅度(LAGE)检测 SDBG:先计算4时相血糖平均值,再将4时相血糖值与平均值之差的平方和除以6,最后将值开方。LAGE:最高血糖值与最低血糖值之差。

1.5.4 空腹血清胰岛素(Fins)含量 于干预前及针刺4周后,将各组大鼠禁食12 h,自由饮水。于18时血糖检测完毕后,采用眼眶静脉取血法,取3 mL血液,然后将血液低温离心,取上清液,采用ELISA检测Fins。

1.5.5 胰腺荧光TUNEL染色 于针刺4周后,眼眶静脉取血完毕后,将各组大鼠处死,分离胰腺并于冰生理盐水中洗去血液至液体澄清。固定后将石蜡切片脱蜡,滴加破膜工作液覆盖组织,孵育漂洗后,滴加配制好的TUNEL混合液覆盖组织,37℃恒温箱孵育2 h,而后进行DAPI复染细胞核,再用抗荧光淬灭封片剂封片,最后于荧光显微镜下观察并采集图像。采用凋亡细胞数/胰岛总细胞核数×100%,计算凋亡指数(AI),取平均值。

1.5.6 蛋白质印迹法(Western blot)检测PI3K、AKT、p-AKT、BMAL1蛋白表达 取胰腺组织加入裂解液研磨,离心后取上清液,采用BCA法测定蛋白质浓度,根据预实验结果调整各个蛋白的上样量,上样后进行电泳、转膜,并将膜置于封闭液中封闭2 h,后配置合适比例的一抗封闭液(PI3K、AKT、BMAL1稀释比例 1∶1 000;p-AKT 稀释比例 1∶800),于 4 ℃孵育过夜后再加二抗封闭液室温孵育,滴入ECL plus超敏发光液,并采用凝胶成像系统分析灰度值。

1.6 统计学方法 选取SPSS 24软件进行统计学分析。实验数据采用均数±标准差(±s)表示,多组间计量资料比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD法,组内前后比较采用配对t检验。重复测量资料比较采用重复测量方差分析,P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 造模前大鼠精神状态反应敏捷,行动迅速,毛发光泽,便质成型;造模后精神萎靡,反应迟钝,眯眼少动,缩肩拱背,体型消瘦,毛发蓬松,毛色暗黄,食量倍增,频繁饮水,尿量增加,大便溏稀。干预结束后,针刺组大鼠精神状态良好,反应敏捷,体质量增加明显,毛发顺泽,食饮水及尿量如常,便质基本成形。

2.2 4 时相血糖值 如表1所示,干预前与空白组比较,模型组与针刺组各时相即时血糖显著升高(P<0.01),但针刺组与模型组相比无统计学意义(P>0.05)。干预后,针刺组较模型组各时相即时血糖显著下降(P<0.01),但两组各时相即时血糖均显著高于空白组(P<0.01)。模型组血糖与干预前相比无显著变化(P>0.05),而针刺组血糖显著下降(P<0.01)。

表1 各组大鼠干预前后0、6、12、18时即时血糖比较(±s)Tab.1 Comparison of 0,6,12,18 hours of glucose levels in rats of each group before and after intervention(±s)mmol/L

表1 各组大鼠干预前后0、6、12、18时即时血糖比较(±s)Tab.1 Comparison of 0,6,12,18 hours of glucose levels in rats of each group before and after intervention(±s)mmol/L

注:同一时相与空白组比较,**P<0.01;同一时相与模型组比较,##P<0.01;同一组别与干预前比较,▲▲P<0.01。

组别 动物数 0时血糖 6时血糖 12时血糖 18时血糖干预前 干预后 干预前 干预后 干预前 干预后 干预前 干预后空白组 10 6.1±0.72 6.1±0.84 6.2±0.65 6.1±0.73 5.5±0.71 5.5±0.63 5.3±0.66 5.1±0.74模型组 10 22.5±0.92** 22.4±1.14** 20.3±1.36** 21.2±1.43** 18.5±1.52** 19.1±1.62** 21.3±1.21**22.0±1.32**针刺组 10 22.6±1.23** 9.0±0.93**##▲▲ 19.5±1.52** 9.4±0.75**##▲▲ 18.8±1.08** 8.5±0.54**##▲▲ 21.5±2.76** 7.7±0.62**##▲▲

2.3 SDBG与LAGE值 如表2所示,干预前与空白组比较,模型组与针刺组SDBG与LAGE显著升高(P<0.01),但针刺组与模型组相比无统计学意义(P>0.05)。干预后,针刺组较模型组SDBG与LAGE显著下降(P<0.01),但两组 SDBG 与 LAGE 均显著高于空白组(P<0.01)。模型组 SDBG 与 LAGE 与干预前相比无显著变化(P>0.05),而针刺组 SDBG 与LAGE 显著下降(P<0.01)。

表2 各组大鼠干预前后SDBG与LAGE值比较(±s)Tab.2 Comparison of SDBG and LAGE levels in rats of each group before and after intervention(±s)mmol/L

表2 各组大鼠干预前后SDBG与LAGE值比较(±s)Tab.2 Comparison of SDBG and LAGE levels in rats of each group before and after intervention(±s)mmol/L

注:与空白组比较,**P<0.01;与模型组比较,##P<0.01;与干预前比较,▲▲P<0.01。

组别 动物数 SDBG LAGE干预前 干预后 干预前 干预后空白组 10 0.6±0.48 0.6±0.36 1.7±1.03 1.7±1.11模型组 10 4.2±0.78**4.3±0.85** 7.0±1.93**7.1±2.09**针刺组 10 4.1±0.63**2.8±0.57**##▲▲ 7.1±2.03**4.8±2.13**##▲▲

2.4 Fins含量 由表3可知,干预前与空白组比较,模型组与针刺组 Fins含量显著降低(P<0.01),但针刺组与模型组相比无统计学意义(P>0.05)。干预后针刺组较模型组Fins含量显著升高(P<0.01),但两组Fins含量均显著低于空白组(P<0.01)。模型组 Fins含量与干预前相比无显著变化(P>0.05),而针刺组 Fins含量显著升高(P<0.01)。

表3 各组大鼠干预前后Fins的比较(±s)Tab.3 Comparison of Fins levels in rats of each group before and after intervention(±s) μU/L

表3 各组大鼠干预前后Fins的比较(±s)Tab.3 Comparison of Fins levels in rats of each group before and after intervention(±s) μU/L

注:与空白组比较,**P<0.01;与模型组比较,##P<0.01;与干预前比较,▲▲P<0.01。

组别 动物数 Fins干预前 干预后空白组 10 72.91±7.62 69.51±3.36模型组 10 36.45±1.58** 37.43±1.65**针刺组 10 35.25±4.76** 54.91±2.38**##▲▲

2.5 胰腺荧光TUNEL染色及AI值 由图1、表4可知,镜下空白组胰岛未见明显凋亡,仅有极少量散在绿色着色的凋亡细胞。而模型组可见大量凋亡细胞,AI值则明显高于空白组(P<0.01)。经针刺后,针刺组凋亡情况明显改善,可见夹杂少量凋亡细胞,AI值较模型组明显下降(P<0.01)。

图1 各组胰腺荧光TUNEL染色(×200)Fig.1 Fluorescence TUNEL staining of pancreas of each group(×200)

表4 干预后各组大鼠胰腺细胞凋亡率的比较(±s)Tab.4 Comparison of lslet cell apoptosis rate in rats of each group of after intervention(±s)%

表4 干预后各组大鼠胰腺细胞凋亡率的比较(±s)Tab.4 Comparison of lslet cell apoptosis rate in rats of each group of after intervention(±s)%

注:与空白组比较,**P<0.01;与模型组比较,##P<0.01。

组别 动物数 AI空白组 10 2.53±0.79模型组 10 87.32±5.31**针刺组 10 40.59±7.28##

2.6 各组大鼠 PI3K、AKT、p-AKT、BMAL1 蛋白检测 由表5、图2可知,干预后针刺组各蛋白表达较模型组显著升高(P<0.01),但均显著低于空白组(P<0.01)。

表5 干预后各组大鼠PI3K、AKT、p-AKT、BMAL1蛋白相对表达量(±s)Tab.5Comparison of PI3K,AKT,p-AKT,BMAL1 levels in rats of each group of after intervention(±s)

表5 干预后各组大鼠PI3K、AKT、p-AKT、BMAL1蛋白相对表达量(±s)Tab.5Comparison of PI3K,AKT,p-AKT,BMAL1 levels in rats of each group of after intervention(±s)

注:与空白组比较,**P<0.01;与模型组比较,##P<0.01。

组别 动物数 PI3K AKT p-AKT BMAL1空白组 10 1.02±0.03 0.93±0.04 0.74±0.06 0.81±0.03模型组 10 0.41±0.04** 0.36±0.06** 0.26±0.06** 0.23±0.03**针刺组 10 0.58±0.08**##0.52±0.07**##0.53±0.09**##0.42±0.04**##

图2 干预后各组大鼠PI3K、AKT、p-AKT、BMAL1的蛋白表达Fig.2 Protein expression of PI3K,AKT,p-AKT and BMAL1 in rats of each group after intervention

3 讨论

人体的生理、代谢方面存在昼夜节律性,这种节律性受体内生物钟控制。人体生物钟主要由位于视交叉上核的中央生物钟和外周生物钟(如胰岛、肝脏、肌肉等)组成。中央生物钟通过神经、体液调控外周生物钟,但葡萄糖信号可使外周生物钟(如胰岛)摆脱中央生物钟控制,而具有相对自主的生物节律,其中胰岛的自主生物节律性主要体现在胰岛素分泌方面[12]。胰岛功能的完整性是胰岛素分泌的前提。有资料显示,T2DM患者胰岛分泌的正常节律消失,胰岛素脉冲式的分泌模式紊乱,血糖昼夜节律失衡[13]。故恢复胰岛功能及正常的“生物钟效应”对维持T2DM血糖昼夜节律至关重要。

昼夜节律产生和维持的分子机制是由BMAL1与生物钟循环输出蛋白(CLOCK)形成异二聚体作为节律性震荡的起始,随后与其他时钟基因结合,形成以约24 h为周期的节律性表达振荡。PI3K/AKT通路是BMAL1的上游通路,有别于生物钟基因(CLOCK),BMAL1的缺乏会出现高血糖和葡萄糖刺激下的胰岛素分泌紊乱等现象[14]。BMAL1蛋白可与胰岛素基因启动子E-box结合,调控胰岛素的表达,并可促进胰岛素分泌囊泡的胞吐。敲除BMAL1可影响胰岛节律性胞吐[15]。故PI3K/AKT/BMAL1通路与T2DM血糖昼夜节律失衡关系密切。

同时,人体五脏六腑与自然界生物节律亦有联系,如《灵枢·经别》云:“余闻人之合于天道也,内有五脏,以应五音、五色、五时、五味、五位也;外有六腑,以应六律,六律建阴阳诸经,而合之十二月、十二辰、十二节、十二经水、十二时、十二经脉者,此五脏六腑之所以应天道。”而脾病亦会导致生物节律性的失常,如《素问·藏气法时论》曰:“脾病者,日昳慧,日出甚,下晡静。”其中“日出甚”即言明脾病患者在黎明之时病情严重,而T2DM的“黎明现象”正是发于此时,这也为生物钟紊乱从脾论治提供理论依据。同时,血糖是由水谷精微化生而成,源于脾胃的升降运化,故血糖异常亦应从脾论治。《素问·遗篇》曰:“脾者,谏议之官,知周出焉。”笔者认为脾谏议是监督防卫之功的体现。血糖昼夜节律失衡正是由于脾胃受损,脾虚失运,运化失节,谏议失司而引起。因此,提出血糖昼夜节律失衡应从脾论治,调理脾胃升降运化,复其谏议之职,使运化有节。

本研究结果显示,造模成功后,大鼠显示出了脾胃升降运化失常所引起的一系列症状,如精神萎靡,体型消瘦,毛色暗黄,大便溏稀等。在针刺后上述症状较前改善。此外,在正常情况下大鼠血糖分别于6、18时为一昼夜血糖变化的波峰及波谷,并于0、24时回落至基本水平[16],而T2DM大鼠的血糖则无昼夜波动的节律性,而呈现出异常高水平[17],故采用4时相即时血糖以评价血糖波动的节律性,但波动的节律性亦不可过度离散,故进一步结合SDBG与LAGE以评价其离散程度。研究表明,干预前由于胰腺的破坏,故胰岛素分泌不足,TUNEL染色亦证明胰岛细胞存在大量凋亡。因此,干预前针刺、模型组Fins含量较空白组下降,各时相即时血糖、SDBG、LAGE及AI值较空白组升高,血糖昼夜节律失衡。随着针刺的干预,AI值降低,提示胰岛修复,而胰岛功能的完整性又是胰岛素分泌的前提,随着胰岛修复,胰岛素节律性分泌得到改善,针刺组各时相血糖、SDBG、LAGE趋于正常,且针刺结束后Fins含量亦接近空白组,血糖昼夜节律失衡得到纠正。同时,治疗前模型组大鼠PI3K/AKT通路各蛋白表达量降低,信号下传障碍,BMAL1表达量减少,是血糖昼夜节律失衡的机制。但随着针刺的介入,针刺对PI3K/AKT/BMAL1通路具有良性调节作用,可提高 PI3K、AKT、p-AKT、BMAL1 蛋白的表达量,促进针刺信号的下传,随着BMAL1的表达增加,其可促进胰岛素生成,改善血糖分泌的节律性,故使各时相血糖下降,血糖昼夜节律得到改善。

调理脾胃针法正是用于治疗脾胃升降运化失常的1种针刺方法,中脘可助运化,功善升清降浊;足三里可益脾胃,补脏腑之虚损;阴陵泉可化湿滞,开通水道,上述3个穴位相配健脾祛湿,调中焦之升降运化。三阴交、地机、血海可化血中之浊瘀,祛瘀生新,调和气血。丰隆可化湿祛痰,和胃降逆。曲池、合谷通降胃肠,荡涤邪秽。太冲平肝调肝,防肝木横克脾土。诸穴合用,使升降有序,健运有常,精微得布,脏腑得养,谏议之职可复[18]。

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