基于胰腺PI3K/AKT/BMAL1通路探讨针刺对2型糖尿病大鼠血糖昼夜节律的影响*

王栩，张月，刘汉东，李洁，赵文清，周琼阳，张智龙

（1．天津市中医药研究院附属医院针灸科，天津 300120；2．天津市红桥医院中医科，天津 300131；3．天津中医药大学研究生院，天津 301617）

糖尿病严重威胁着人类的健康，根据2019年国际糖尿病联盟发布的数据显示，至2045年将有1．472亿人患有糖尿病[1]。在2020年美国糖尿病学会颁布糖尿病医学诊疗标准中，新增了对2型糖尿病（T2DM）患者应用动态血糖谱报告评估血糖管理的推荐[2]，由此说明血糖昼夜节律的调节对T2DM的治疗具有重要意义。血糖昼夜节律受胰岛生物钟节律的影响。目前，改善血糖昼夜节律的西药主要包括胰高血糖素样肽-1受体激动剂、磺脲类等，但上述药物存在诸多不良反应，如低血糖、胃肠道反应、皮疹等，影响药物的长期应用。血糖昼夜节律失衡而引起的持续高血糖可引起多种急慢性并发症，严重影响了患者的生活质量。

研究认为，脑和肌肉芳香烃受体核转位蛋白1（BMAL1）可调节胰岛生物钟的节律性，维持血糖昼夜节律[3]。其上游受磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）通路的调控，PI3K可磷酸化下游丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT）的苏氨酸 308位点（pAkt T308）而激活AKT[4]。而AKT又可进一步激活BMAL1，从而调节血糖昼夜节律[5]。同时，针灸对T2DM具有治疗作用，1项系统评价表明单纯针刺和针刺配合降糖药均可降低T2DM患者空腹及餐后2 h血糖、糖化血红蛋白，且疗效优于假针刺及单纯使用降糖药[6]。笔者前期的临床及机制研究显示，调理脾胃针法可有效降低血糖；改善PI3K通路上下游关键蛋白表达及胰岛结构[7-9]，但对PI3K/AKT/BMAL1介导针刺调节血糖昼夜节律的作用尚不明确。故本研究以高脂高糖结合小剂量腹腔注射链脲佐菌素（STZ）的T2DM大鼠为针刺效应平台，重点研究调理脾胃针法调节血糖昼夜节律失衡的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠36只，体质量（120±20）g，5周龄。购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物许可证编号：SCXK（京）2019-0010。动物饲养于天津市中国医学科学院放射医学研究所，研究方案获研究所伦理委员会批准（No．IRM-DWLL-2020132），实验动物的处置符合2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 主要试剂及仪器 STZ（S0130，Sigma公司），大鼠胰岛素（INS）酶联免疫吸附法（ELISA）Kit（CSB-E05070r，武汉华美生物公司），PI3K、AKT、p-AKT、BMAL1 抗 体（ab183957，ab233755，ab38449，ab273648，英国Abcam公司），二抗（北京博奥森生物技术有限公司），ECLplus超敏发光液（PE0010，北京索莱宝公司），TUNEL试剂盒（Roche公司）；中研太和针灸针（0．3 mm×13 mm），血糖仪及试纸（越佳型至新，雅培公司），酶标仪（美国Bio-Tek公司），凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司），脱水机及包埋机（武汉俊杰电子有限公司），病理切片机（上海徕卡仪器有限公司），荧光显微镜（OLYMPUS公司）。

1.3 模型建立 将大鼠适应性喂养1周后，采用高脂高糖饲料喂养2个月（高脂高糖饲料配方：蔗糖20%、猪油10%、蛋黄粉5%、胆固醇1%、猪胆汁酸钠0．1%、普通饲料63．9%）。后将造模大鼠禁食12 h，并按体质量一次性快速腹腔注射STZ溶液（以 0．1 mol枸橼酸盐缓冲液配制，pH=4．6），并按注射体积10 mL/kg，注射剂量25 mg/kg，STZ浓度2．5 mg/mL注射，30 min内使用完。于注射完成72 h后采用尾静脉取血方式，使用血糖仪测量血糖，以连续5 d随机血糖＞16．7 mmol/L为T2DM造模成功[10]。动物成模后均予以普通饲料喂养。

1.4 动物分组及干预方法 采用随机数字表法将36只大鼠随机分为空白组10只与造模组26只，造模组按照上述造模方法造模，最终死亡6只，并将剩余的20只大鼠随机分为针刺组10只，模型组10只。针刺组取穴为：曲池、合谷、血海、足三里、丰隆、阴陵泉、地机、三阴交、太冲（以上穴位均取双侧），中脘，具体穴位定位参照李忠仁主编的《实验针灸学》[11]。具体操作：首先将大鼠置于自制大鼠针刺服中[8]，以减少躁动。身着大鼠针刺服后，大鼠躁动基本消失，可同时多针刺、久留针，并可多只同时针刺操作，具有针刺可行性。而后穴位与针具常规消毒，选用中研太和0．3 mm×13 mm针灸针进行针刺，并于 23：30、05：30、11：30、17：30 进行针刺，每次留针30 min，每日治疗1次，每周治疗5次，共治疗4周。空白组及模型组不予干预。

1.5 检测指标

1.5.1 一般情况 对造模前后大鼠的精神状态、毛色、进食量、饮水量、尿量、便质进行观察。

1.5.2 4时相即时血糖检测 于干预前及针刺4周后，将各组大鼠禁食12 h，自由饮水。分别于0、6、12、18时采用尾静脉取血法，用血糖仪测量即时血糖。

1.5.3 平均血糖的标准差（SDBG）和最大血糖波动幅度（LAGE）检测 SDBG：先计算4时相血糖平均值，再将4时相血糖值与平均值之差的平方和除以6，最后将值开方。LAGE：最高血糖值与最低血糖值之差。

1.5.4 空腹血清胰岛素（Fins）含量 于干预前及针刺4周后，将各组大鼠禁食12 h，自由饮水。于18时血糖检测完毕后，采用眼眶静脉取血法，取3 mL血液，然后将血液低温离心，取上清液，采用ELISA检测Fins。

1.5.5 胰腺荧光TUNEL染色 于针刺4周后，眼眶静脉取血完毕后，将各组大鼠处死，分离胰腺并于冰生理盐水中洗去血液至液体澄清。固定后将石蜡切片脱蜡，滴加破膜工作液覆盖组织，孵育漂洗后，滴加配制好的TUNEL混合液覆盖组织，37℃恒温箱孵育2 h，而后进行DAPI复染细胞核，再用抗荧光淬灭封片剂封片，最后于荧光显微镜下观察并采集图像。采用凋亡细胞数/胰岛总细胞核数×100%，计算凋亡指数（AI），取平均值。

1.5.6 蛋白质印迹法（Western blot)检测PI3K、AKT、p-AKT、BMAL1蛋白表达 取胰腺组织加入裂解液研磨，离心后取上清液，采用BCA法测定蛋白质浓度，根据预实验结果调整各个蛋白的上样量，上样后进行电泳、转膜，并将膜置于封闭液中封闭2 h，后配置合适比例的一抗封闭液（PI3K、AKT、BMAL1稀释比例 1∶1 000；p-AKT 稀释比例 1∶800），于 4 ℃孵育过夜后再加二抗封闭液室温孵育，滴入ECL plus超敏发光液，并采用凝胶成像系统分析灰度值。

1.6 统计学方法 选取SPSS 24软件进行统计学分析。实验数据采用均数±标准差（±s）表示，多组间计量资料比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，组内前后比较采用配对t检验。重复测量资料比较采用重复测量方差分析，P＜0．05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 造模前大鼠精神状态反应敏捷，行动迅速，毛发光泽，便质成型；造模后精神萎靡，反应迟钝，眯眼少动，缩肩拱背，体型消瘦，毛发蓬松，毛色暗黄，食量倍增，频繁饮水，尿量增加，大便溏稀。干预结束后，针刺组大鼠精神状态良好，反应敏捷，体质量增加明显，毛发顺泽，食饮水及尿量如常，便质基本成形。

2.2 4 时相血糖值 如表1所示，干预前与空白组比较，模型组与针刺组各时相即时血糖显著升高（P＜0．01），但针刺组与模型组相比无统计学意义（P＞0．05）。干预后，针刺组较模型组各时相即时血糖显著下降（P＜0．01），但两组各时相即时血糖均显著高于空白组（P＜0．01）。模型组血糖与干预前相比无显著变化（P＞0．05），而针刺组血糖显著下降（P＜0．01）。

表1 各组大鼠干预前后0、6、12、18时即时血糖比较（±s）Tab.1 Comparison of 0，6，12，18 hours of glucose levels in rats of each group before and after intervention（±s）mmol/L

表1 各组大鼠干预前后0、6、12、18时即时血糖比较（±s）Tab.1 Comparison of 0，6，12，18 hours of glucose levels in rats of each group before and after intervention（±s）mmol/L

注：同一时相与空白组比较，**P＜0．01；同一时相与模型组比较，##P＜0．01；同一组别与干预前比较，▲▲P＜0．01。

组别 动物数 0时血糖 6时血糖 12时血糖 18时血糖干预前 干预后 干预前 干预后 干预前 干预后 干预前 干预后空白组 10 6．1±0．72 6．1±0．84 6．2±0．65 6．1±0．73 5．5±0．71 5．5±0．63 5．3±0．66 5．1±0．74模型组 10 22．5±0．92** 22．4±1．14** 20．3±1．36** 21．2±1．43** 18．5±1．52** 19．1±1．62** 21．3±1．21**22．0±1．32**针刺组 10 22．6±1．23** 9．0±0．93**##▲▲ 19．5±1．52** 9．4±0．75**##▲▲ 18．8±1．08** 8．5±0．54**##▲▲ 21．5±2．76** 7．7±0．62**##▲▲

2.3 SDBG与LAGE值 如表2所示，干预前与空白组比较，模型组与针刺组SDBG与LAGE显著升高（P＜0．01），但针刺组与模型组相比无统计学意义（P＞0．05）。干预后，针刺组较模型组SDBG与LAGE显著下降（P＜0．01），但两组 SDBG 与 LAGE 均显著高于空白组（P＜0．01）。模型组 SDBG 与 LAGE 与干预前相比无显著变化（P＞0．05），而针刺组 SDBG 与LAGE 显著下降（P＜0．01）。

表2 各组大鼠干预前后SDBG与LAGE值比较（±s）Tab.2 Comparison of SDBG and LAGE levels in rats of each group before and after intervention（±s）mmol/L

表2 各组大鼠干预前后SDBG与LAGE值比较（±s）Tab.2 Comparison of SDBG and LAGE levels in rats of each group before and after intervention（±s）mmol/L

注：与空白组比较，**P＜0．01；与模型组比较，##P＜0．01；与干预前比较，▲▲P＜0．01。

组别 动物数 SDBG LAGE干预前 干预后 干预前 干预后空白组 10 0．6±0．48 0．6±0．36 1．7±1．03 1．7±1．11模型组 10 4．2±0．78**4．3±0．85** 7．0±1．93**7．1±2．09**针刺组 10 4．1±0．63**2．8±0．57**##▲▲ 7．1±2．03**4．8±2．13**##▲▲

2.4 Fins含量 由表3可知，干预前与空白组比较，模型组与针刺组 Fins含量显著降低（P＜0．01），但针刺组与模型组相比无统计学意义（P＞0．05）。干预后针刺组较模型组Fins含量显著升高（P＜0．01），但两组Fins含量均显著低于空白组（P＜0．01）。模型组 Fins含量与干预前相比无显著变化（P＞0．05），而针刺组 Fins含量显著升高（P＜0．01）。

表3 各组大鼠干预前后Fins的比较（±s）Tab.3 Comparison of Fins levels in rats of each group before and after intervention（±s） μU/L

表3 各组大鼠干预前后Fins的比较（±s）Tab.3 Comparison of Fins levels in rats of each group before and after intervention（±s） μU/L

注：与空白组比较，**P＜0．01；与模型组比较，##P＜0．01；与干预前比较，▲▲P＜0．01。

组别 动物数 Fins干预前 干预后空白组 10 72．91±7．62 69．51±3．36模型组 10 36．45±1．58** 37．43±1．65**针刺组 10 35．25±4．76** 54．91±2．38**##▲▲

2.5 胰腺荧光TUNEL染色及AI值 由图1、表4可知，镜下空白组胰岛未见明显凋亡，仅有极少量散在绿色着色的凋亡细胞。而模型组可见大量凋亡细胞，AI值则明显高于空白组（P＜0．01）。经针刺后，针刺组凋亡情况明显改善，可见夹杂少量凋亡细胞，AI值较模型组明显下降（P＜0．01）。

图1 各组胰腺荧光TUNEL染色（×200）Fig.1 Fluorescence TUNEL staining of pancreas of each group(×200)

表4 干预后各组大鼠胰腺细胞凋亡率的比较（±s）Tab.4 Comparison of lslet cell apoptosis rate in rats of each group of after intervention（±s）%

表4 干预后各组大鼠胰腺细胞凋亡率的比较（±s）Tab.4 Comparison of lslet cell apoptosis rate in rats of each group of after intervention（±s）%

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01。

组别 动物数 AI空白组 10 2.53±0.79模型组 10 87.32±5.31**针刺组 10 40.59±7.28##

2.6 各组大鼠 PI3K、AKT、p-AKT、BMAL1 蛋白检测 由表5、图2可知，干预后针刺组各蛋白表达较模型组显著升高（P＜0．01），但均显著低于空白组（P＜0．01）。

表5 干预后各组大鼠PI3K、AKT、p-AKT、BMAL1蛋白相对表达量（±s）Tab.5Comparison of PI3K，AKT，p-AKT，BMAL1 levels in rats of each group of after intervention（±s）

表5 干预后各组大鼠PI3K、AKT、p-AKT、BMAL1蛋白相对表达量（±s）Tab.5Comparison of PI3K，AKT，p-AKT，BMAL1 levels in rats of each group of after intervention（±s）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01。

组别 动物数 PI3K AKT p-AKT BMAL1空白组 10 1.02±0.03 0.93±0.04 0.74±0.06 0.81±0.03模型组 10 0.41±0.04** 0.36±0.06** 0.26±0.06** 0.23±0.03**针刺组 10 0.58±0.08**##0.52±0.07**##0.53±0.09**##0.42±0.04**##

图2 干预后各组大鼠PI3K、AKT、p-AKT、BMAL1的蛋白表达Fig.2 Protein expression of PI3K，AKT，p-AKT and BMAL1 in rats of each group after intervention

3 讨论

人体的生理、代谢方面存在昼夜节律性，这种节律性受体内生物钟控制。人体生物钟主要由位于视交叉上核的中央生物钟和外周生物钟（如胰岛、肝脏、肌肉等）组成。中央生物钟通过神经、体液调控外周生物钟，但葡萄糖信号可使外周生物钟（如胰岛）摆脱中央生物钟控制，而具有相对自主的生物节律，其中胰岛的自主生物节律性主要体现在胰岛素分泌方面[12]。胰岛功能的完整性是胰岛素分泌的前提。有资料显示，T2DM患者胰岛分泌的正常节律消失，胰岛素脉冲式的分泌模式紊乱，血糖昼夜节律失衡[13]。故恢复胰岛功能及正常的“生物钟效应”对维持T2DM血糖昼夜节律至关重要。

昼夜节律产生和维持的分子机制是由BMAL1与生物钟循环输出蛋白（CLOCK）形成异二聚体作为节律性震荡的起始，随后与其他时钟基因结合，形成以约24 h为周期的节律性表达振荡。PI3K/AKT通路是BMAL1的上游通路，有别于生物钟基因（CLOCK），BMAL1的缺乏会出现高血糖和葡萄糖刺激下的胰岛素分泌紊乱等现象[14]。BMAL1蛋白可与胰岛素基因启动子E-box结合，调控胰岛素的表达，并可促进胰岛素分泌囊泡的胞吐。敲除BMAL1可影响胰岛节律性胞吐[15]。故PI3K/AKT/BMAL1通路与T2DM血糖昼夜节律失衡关系密切。

同时，人体五脏六腑与自然界生物节律亦有联系，如《灵枢·经别》云：“余闻人之合于天道也，内有五脏，以应五音、五色、五时、五味、五位也；外有六腑，以应六律，六律建阴阳诸经，而合之十二月、十二辰、十二节、十二经水、十二时、十二经脉者，此五脏六腑之所以应天道。”而脾病亦会导致生物节律性的失常，如《素问·藏气法时论》曰：“脾病者，日昳慧，日出甚，下晡静。”其中“日出甚”即言明脾病患者在黎明之时病情严重，而T2DM的“黎明现象”正是发于此时，这也为生物钟紊乱从脾论治提供理论依据。同时，血糖是由水谷精微化生而成，源于脾胃的升降运化，故血糖异常亦应从脾论治。《素问·遗篇》曰：“脾者，谏议之官，知周出焉。”笔者认为脾谏议是监督防卫之功的体现。血糖昼夜节律失衡正是由于脾胃受损，脾虚失运，运化失节，谏议失司而引起。因此，提出血糖昼夜节律失衡应从脾论治，调理脾胃升降运化，复其谏议之职，使运化有节。

本研究结果显示，造模成功后，大鼠显示出了脾胃升降运化失常所引起的一系列症状，如精神萎靡，体型消瘦，毛色暗黄，大便溏稀等。在针刺后上述症状较前改善。此外，在正常情况下大鼠血糖分别于6、18时为一昼夜血糖变化的波峰及波谷，并于0、24时回落至基本水平[16]，而T2DM大鼠的血糖则无昼夜波动的节律性，而呈现出异常高水平[17]，故采用4时相即时血糖以评价血糖波动的节律性，但波动的节律性亦不可过度离散，故进一步结合SDBG与LAGE以评价其离散程度。研究表明，干预前由于胰腺的破坏，故胰岛素分泌不足，TUNEL染色亦证明胰岛细胞存在大量凋亡。因此，干预前针刺、模型组Fins含量较空白组下降，各时相即时血糖、SDBG、LAGE及AI值较空白组升高，血糖昼夜节律失衡。随着针刺的干预，AI值降低，提示胰岛修复，而胰岛功能的完整性又是胰岛素分泌的前提，随着胰岛修复，胰岛素节律性分泌得到改善，针刺组各时相血糖、SDBG、LAGE趋于正常，且针刺结束后Fins含量亦接近空白组，血糖昼夜节律失衡得到纠正。同时，治疗前模型组大鼠PI3K/AKT通路各蛋白表达量降低，信号下传障碍，BMAL1表达量减少，是血糖昼夜节律失衡的机制。但随着针刺的介入，针刺对PI3K/AKT/BMAL1通路具有良性调节作用，可提高 PI3K、AKT、p-AKT、BMAL1 蛋白的表达量，促进针刺信号的下传，随着BMAL1的表达增加，其可促进胰岛素生成，改善血糖分泌的节律性，故使各时相血糖下降，血糖昼夜节律得到改善。

调理脾胃针法正是用于治疗脾胃升降运化失常的1种针刺方法，中脘可助运化，功善升清降浊；足三里可益脾胃，补脏腑之虚损；阴陵泉可化湿滞，开通水道，上述3个穴位相配健脾祛湿，调中焦之升降运化。三阴交、地机、血海可化血中之浊瘀，祛瘀生新，调和气血。丰隆可化湿祛痰，和胃降逆。曲池、合谷通降胃肠，荡涤邪秽。太冲平肝调肝，防肝木横克脾土。诸穴合用，使升降有序，健运有常，精微得布，脏腑得养，谏议之职可复[18]。