干扰素受体1沉默的人二倍体MRC⁃5细胞系对水痘⁃带状疱疹病毒复制的影响

杨骁，姜承瀚，孙博，谷铁军，万明明，孙捷，丁雪，王岑嵘，周恩同，姜皓，苏维恒

1.吉林大学生命科学学院艾滋病疫苗国家工程实验室，吉林 长春 130012；2.延边大学农学院园艺园林系，吉林 延边朝鲜族自治州 133002；3.吉林大学中日联谊医院手术室，吉林 长春 130033

水痘和带状疱疹是全球范围内广泛流行的两种疾病，均由水痘⁃带状疱疹病毒（varicella⁃zorter virus，VZV）引起［1］。VZV 是一种双链DNA 病毒，该病毒在人群中通过接触飞沫感染，通常初次感染于儿童时期，临床表现为水痘。水痘患者痊愈后，病毒会潜伏于患者神经节中，并有一定几率重新激活，导致带状疱疹。该疾病会导致不同程度的疱疹后神经痛，并且可能引起较为严重的并发症，甚至导致死亡［2］。

疫苗是防控VZV 的最好手段之一。自20 世纪60年代以来，基于细胞培养的疫苗逐渐成为病毒性疫苗的主要生产方式。可用于疫苗生产的细胞系包括原代细胞系（地鼠肾细胞、鸡胚细胞）、二倍体细胞系（人二倍体细胞、猴二倍体细胞）、传代细胞系（Vero细胞等）。目前常见的VZV 疫苗包括美国Merck 公司的 Varivax 和 Zostavax 以及英国 GSK 的 Varilrix等［3］。基于人二倍体细胞的生产模式，在安全性上优势明显，特别在去除疫苗中宿主细胞的DNA 污染上［4⁃5］。如 1995年批准上市的针对水痘的减毒活疫苗Varivax（Merck）和2006年批准上市的针对带状疱疹的减毒活疫苗Zostavax（Merck）均使用人二倍体细胞生产［6⁃7］。但人二倍体细胞培养技术难度较大，疫苗产量低，生产成本较高，造成疫苗价格昂贵，在发展中国家发展缓慢难以普及［8⁃9］。面对人二倍体细胞在疫苗生产中的困境，一些病毒疫苗选择使用非洲绿猴肾Vero 细胞生产，虽然增加了疫苗因非人DNA污染带来的安全隐患，但大幅提高了疫苗产量。如狂犬病病毒在Vero细胞中的复制水平较人二倍体细胞MRC⁃5高10倍左右［10］；流感病毒在Vero细胞中的复制水平也显著高于人二倍体细胞［11］。但对于VZV，由于Vero细胞VZV受体的缺失，无法使用Vero细胞提高其疫苗产量，人二倍体细胞成为重要的VZV 减毒活疫苗生产细胞系。因此，探索病毒在人二倍体细胞中复制水平低的原因，寻找合适的方法提高病毒在人二倍体细胞中的复制水平，增加疫苗尤其是VZV减毒活疫苗产量，成为急需解决的问题。

1957年，科学家发现了一个非常重要的细胞因子——干扰素（interferon，IFN），不仅具有直接抗病毒作用，还具有免疫增强作用［12⁃14］。IFN 应答作为重要的先天免疫途径，主要通过识别病毒的特定特征而被激活，最终产生抗病毒因子，达到清除病毒的目的。病毒进入机体后，其不同于宿主的特点如双链RNA、三磷酸末端的 RNA、逆转录RNA 和CpG 被特定模式识别受体识别，激活IFNα／β表达［15］。IFNα／β分泌并被周边细胞的IFN 受体识别，激活细胞内部的IFN 信号传导，最终诱导产生如蛋白激酶RNA（protein kinase RNA，PKR）、2'，5'⁃寡腺苷酸合成酶1（2'，5'⁃oligoadenylate synthetase 1，OAS1）等病毒剪切因子［16⁃17］。通过细胞吞噬、病毒基因组剪切等方式，清除病毒［18⁃20］。IFN 应答的抗病毒机制抵御病毒入侵的同时，也成为基于细胞生产的疫苗发展的障碍。

如果克服了人二倍体细胞病毒疫苗产量低、价格高的劣势，将对我国基于人二倍体细胞病毒疫苗发展意义重大。本研究通过CRISPR／Cas9基因编辑技术构建 IFN 受体 1（interferon receptor 1，IFNAR1）沉默的 MRC⁃5 细胞系（MRC⁃5IFNAR1⁃），利用其提高VZV 的复制水平，为基于 MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系的疫苗生产模式奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、病毒及质粒 人胚肺成纤维细胞MRC⁃5、非洲绿猴肾Vero 细胞购自ATCC（American Type Culture Collection）；VZV 减毒活病毒疫苗原液（voka株，病毒滴度为105PFU／mL）由长春百克生物科技股份公司提供，于-80 ℃保存；质粒PX458、PX458⁃gRNA购自美国Addgene公司。

1.2 主要试剂及仪器 1%胎牛血清购自美国Gibco公司；RNAprep pure 细胞总RNA 提取试剂盒购自中国 TIANGEN 公司 ；MiniBEST Viral RNA Extraction Kit、qPCR 试剂盒购自中国 TaKaRa Bio 公司；PCR 操作系统CFX96购自美国Bio⁃Rad公司。

1.3 MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系的构建 通过对 MRC⁃5 细胞基因组IFNAR1（Gene ID：3454）区的分析，使用遗传扰动平台（Genetic Perturbation Platform，GPP）网络工具设计靶向的gRNA，并通过CRISPR 分析工具（CRISPR Analysis Tool，CAT）评估gRNA的切割效率。将gRNA克隆至含Cas9 蛋白序列的PX458 质粒中（克隆位点在U6启动子之后），电转（680 V）入MRC⁃5细胞，设原始细胞对照（MRC⁃5）组和PX458 空质粒电转对照（MRC⁃5NC）组；电转后的细胞接种96 孔板，0.8个／孔，用含10%胎牛血清、1%青霉素⁃链霉素和1%L⁃谷氨酰胺的MEM 培养基，37 ℃，5% CO2条件下培养7~10 d，每3 d 更换新鲜培养基，培养过程中添加嘌呤霉素（0.6 μg／mL）。通过Sanger 测序（由库美生物科技有限公司完成）鉴定同基因敲除细胞克隆。测序结果中产生突变的MRC⁃5细胞被分离并传代最终形成3株原始的MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系。细胞系稳定传代5 次后，用RNAprep pure 细胞总RNA 提取试剂盒提取细胞总内源性mRNA，利用IFNAR1引物qRT⁃PCR法检测IFNAR1mRNA相对表达量。引物序列见表1，引物由库美生物科技有限公司合成。反应条件为：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，循环40次；60 ℃ 30 s。所有反应设3个复孔，并使用2-△△Ct法量化。

1.4 MRC⁃5细胞的感染 将MRC⁃5或MRC⁃5IFNAR1⁃细胞接种6孔板，1.3 × 106个／孔，按0.1 MOI感染VZV，于32 ℃，5%CO2培养箱中孵育4 h；无血清MEM 培养基洗涤细胞3次，用含1%胎牛血清的MEM培养基继续培养细胞。感染后24 和168 h 收集细胞和培养上清液，于-80 ℃保存。设原始细胞对照组（MRC⁃5和MRC⁃5IFNAR1⁃组），病毒感染组（MRC⁃5+和MRC⁃5IFNAR1⁃+组）。

1.5 VZV感染MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系对IFN应答水平影响的检测 用RNAprep pure 细胞总RNA 提取试剂盒提取感染后24 h细胞总mRNA，利用IFNβ和OAS1引物qRT⁃PCR法检测IFN应答因子IFNβ和OAS1mRNA相对表达量。引物序列见表1，反应条件同1.3项。

1.6 MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系对 VZV 基因组复制水平影响的检测 利用MiniBEST Viral RNA Extraction Kit提取病毒感染168 h后细胞培养上清中病毒DNA，利用 VZVORF62引物 qRT⁃PCR 法检测病毒 DNA 拷贝数。引物序列见表1，反应条件同1.3项。

表1 qRT⁃PCR引物Tab.1 Primers for qRT⁃PCR

1.7 MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系对 VZV 子代病毒滴度影响的检测 采用空斑形成单位（plaque formation unit，PFU）试验。将病毒感染168 h 后细胞培养上清经10倍梯度稀释后，感染Vero 细胞，37 ℃，5%CO2条件下吸附4 h 后，覆盖一层融化的半固体营养琼脂，使病毒在单层细胞培养中有限扩散，通过统计空斑计算病毒滴度（PFU／mL）。

1.8 统计学分析 使用Prism 9 软件单向方差分析（ANOVA）进行统计学分析，组间比较采用t检验。所有试验重复3次，试验数据用均值±标准偏差（Mean±SD）表示。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1IFNAR1沉默的 MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系的鉴定MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系连续传 5 代后，对IFNAR1基因的测序结果显示，MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系含有稳定的移码突变，突变位点发生在IFNAR1IFNβ 结合域，这些移码突变是IFNAR1彻底沉默的前提条件，见图1。MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系IFNAR1mRNA相对表达量为MRC⁃5细胞的27%（t=24.50，P<0.01），为MRC⁃5NC细胞的24%（t=28.33，P<0.01），差异均有统计学意义，见图2。表明MRC⁃5IFNAR1⁃产生了IFNAR1基因的移码突变，并直接影响细胞内IFNAR1mRNA 的相对表达量，证明了MRC⁃5IFNAR1⁃的稳定性。

图1 MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系测序Fig.1 Sequencing of MRC⁃5IFNAR1⁃cell line

图2 IFNAR1 mRNA相对表达量的qRT⁃PCR检测Fig.2 Determination of relative expression of IFNAR1 mRNA by qRT⁃PCR

2.2 MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系生长状态观察 MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系在细胞生长速度、细胞形态等方面与MRC⁃5细胞无明显差别，见图3。细胞传代至50 代左右，出现贴壁困难、生长缓慢、细胞代谢物增多、细胞死亡等现象。表明MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系极限代次与MRC⁃5细胞一致，IFNAR1基因沉默对 MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系的正常传代无明显影响。

图3 MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系生长状态的显微镜观察Fig.3 Microscopy of growth state of MRC⁃5IFNAR1⁃cell line

2.3 VZV 感染 MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系对 IFN 应答水平的影响 VZV 感染后24 h，与MRC⁃5组相比，MRC⁃5+组 IFN 应答水平显著增加，IFNβ和OAS1mRNA 相对表达量分别增加了92 和133 倍，差异有统计学意义（t分别为16.28和66.78，P均<0.01），见图4。同时VZV感染后24 h，与MRC⁃5+组相比，MRC⁃5IFNAR1⁃+组IFN应答水平显著降低，IFNβ和OAS1mRNA相对表达量分别降低了61%和90%，差异有统计学意义（t分别为18.82 和 16.75，P均<0.01），见图4。表明MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系有效沉默了病毒感染引起的IFN应答。

图4 病毒感染后 24 h MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系 IFN 相关基因相对表达量Fig.4 Relative expression of IFN related genes in MRC⁃5IFNAR1⁃cell line 24 h after virus infection

2.4 MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系对 VZV 基因组复制水平的影响 VZV 感染后168 h，与MRC⁃5+组（2 600）相比，MRC⁃5IFNAR1⁃+组中VZV DNA 拷贝数（14 912）增加 5.7倍，差异有统计学意义（t= 10.51，P <0.01）。表明MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系 IFN 应答水平的降低有效增加了病毒在MRC⁃5细胞中的DNA复制水平。

2.5 MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系对 VZV 子代病毒滴度的影响 VZV 感染后 168 h，与 MRC⁃5+细胞组相比（47 500 PFU／mL），MRC⁃5IFNAR1⁃+细胞组培养上清中VZV 病毒滴度（207 500 PFU／mL）增加4.3 倍，差异有统计学意义（t= 20.24，P <0.01）。表明IFNAR1沉默引起的低IFN 应答水平，提高了VZV 在MRC⁃5细胞中的产量。

3 讨 论

近年来，基于细胞生产的疫苗成为全球预防病毒感染的最有效方法之一［21］。可以用于疫苗生产的细胞系很多，其中基于Vero 细胞生产的灭活病毒疫苗存在非人源DNA 污染物的安全问题。导致这种疫苗产品对质量控制中残留的DNA 要求极高［22］。对更安全疫苗的需求使采用人二倍体细胞如MRC⁃5细胞生产疫苗的策略意义重大［23］。但大多数病毒在人二倍体细胞中复制水平较低，THOULOUZE 等［24］报道了狂犬病病毒对二倍体细胞的感染效率仅为Vero细胞的30%。目前市售的VZV 疫苗多采用人二倍体细胞生产。研究表明，VZV 在MRC⁃5 细胞中的复制水平仅为 Vero 细胞的 1／5［25］。这导致疫苗成本高、产量低，在发展中国家的发展受到一定程度的制约。因此，如何提高病毒在人二倍体细胞中的复制水平，成为基于细胞生产的病毒疫苗的研究热点之一。

通过比较Vero 和MRC⁃5 细胞的不同，关注点集中到 IFN 应答系统上［26，12］。IFN 应答作为先天免疫系统重要的组成部分，其中Ⅰ型IFN 主要被病毒感染激活，行使抗病毒功能。其主要特点为对病毒识别的广谱性和抗病毒因子快速产生。IFN 应答的抗病毒作用可能在人二倍体细胞生产疫苗过程中变成阻碍，尤其是对一些感染早期病毒复制水平较低的病毒，如VZV 和甲型肝炎病毒（HAV）。通过抑制IFN应答的手段，提高这些病毒在人二倍体细胞中复制水平的研究较多。如 2003年，YOUNG 等［27］阐明了IFN 无应答细胞在疫苗开发和制造中的实际应用。2014年，STEWART 等［28］同样通过使用 IFN 抑制剂的方法增加了呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）在人二倍体细胞中的复制能力。HAMA⁃MOTO 等［11］通过使用 siRNA 沉默IRF7基因表达来增加MDCK 细胞中流感病毒的产量。使用抑制IFN应答手段提高VZV在人二倍体细胞中的复制水平研究较少，多数增加VZV 复制水平的研究仅关注毒种的筛选和病毒培养条件的优化［29⁃30］。但这些研究对于病毒复制水平的提高有限，因此，本研究采用抑制IFN 应答的方式来提高 VZV 在 MRC⁃5 细胞中的复制水平。

在对抑制IFN 应答手段的选择中，本研究面向生产考虑到传统IFN 抑制剂和siRNA 在生产应用中的缺陷，这些外源物质的加入难以在疫苗后续生产过程中去除，增加了质量控制的难度，并且将作为成本的一部分提高了疫苗价格。因此，本研究重点探讨IFN应答沉默MRC⁃5细胞系对病毒复制的影响。

本研究使用CRISPR／Cas9 编辑技术成功构建了IFNAR1沉默的 MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系。结果显示，CRISPR／Cas9编辑后IFNAR1基因发生了移码突变，且IFNAR1mRNA 相对表达量显著降低。这种降低可能是由无意义介导的mRNA降解（nonsense⁃mediated mRNA decay，NMD）或无终止密码子引起的mRNA降解（no⁃stop decay，NSD）导致的［31⁃33］。病毒感染后MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系 IFN 应答水平显著降低，VZV 在MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系中的 DNA 复制水平和子代病毒滴度均显著增加。这些结果均证明了MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系对 IFN 应答的有效沉默，提高了 VZV 在 MRC⁃5 细胞中的复制水平，为人二倍体细胞在疫苗生产中的应用提供了新的思路。

MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系的成功建立，解决了多种病毒在MRC⁃5细胞中产量低的问题。与同类研究抑制IFN 的方法如 IFN 抑制剂、siRNA 比较，减少了二次污染，使用方法更为简单。MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系不需要改变传统的疫苗生产方法，明显节约了生产工艺的研发时间和成本，降低了质检检测压力。本研究为改进基于MRC⁃5细胞制备的病毒疫苗提供了新的思路和策略。