外膜蛋白C作为蛋白呈递平台将抗原定位至细菌外膜囊泡表面的可行性

孙京京，黄建东

中国科学院深圳先进技术研究院深圳合成生物学创新研究院，广东 深圳 518055

细菌外膜囊泡（outer membrane vesicle，OMV）是革兰阴性菌生长过程中分泌的球形颗粒，直径为20 ~ 250 nm，表面携带母体菌的外膜成分，如膜蛋白、脂多糖等，内部包裹细菌蛋白质、核酸等［1］。由于OMV 表面含有病原相关分子模式，可激活免疫系统，具有作为疫苗载体的潜力。目前，采用脑膜炎球菌OMV 生产的疫苗已应用于B 群流行性脑脊髓膜炎的预防［2］。近年，有研究将OMV 作为载体用于递送核酸、药物等［3］，还将 OMV 作为抗原呈递平台，经外膜蛋白将异源蛋白呈递于OMV 表面，从而递送至机体内，并获得了较好的免疫效果［4］。目前的研究常用溶血素A（cytolysin A，ClyA）、外膜蛋白A（outer membrane protein A，OmpA）、外膜蛋白 W（outer membrane protein W，OmpW）等膜蛋白与抗原融合表达，将抗原定位至 OMV 表面［5⁃6］。质谱研究证实，OMV 表面还携带其他外膜蛋白，如外膜蛋白C（outer membrane protein C，OmpC）［7］，以OmpC 作为蛋白呈递平台将抗原定位至细菌OMV 表面的相关研究较少。因此，本研究将金黄色葡萄球菌EsxA抗原基因（esxA基因）与ompC基因进行重组，并经原核细胞表达融合蛋白，高速离心法提取重组菌OMV，采用福流纳米流式仪检测OMV 表面的融合蛋白，探讨OmpC 作为蛋白呈递平台将抗原定位至OMV表面的可行性。

1 材料与方法

1.1 菌株、基因及载体 感受态E.coliDH5α和E.coliBL21（DE3）均购自北京全式金生物技术股份有限公司；ompC基因片段及esxA基因均由深圳合成生物学创新研究院制备，载体pET21a由该研究院保存。

1.2 主要试剂及仪器 内切酶SalⅠ、HindⅢ及T4 DNA连接酶均购自英国NEW ENGLAND BioLabs公司；PCR产物回收试剂盒、质粒抽提试剂盒及PrimeSTAR Max DNA Polymerase 均购自日本 TaKaRa 公司；One Step Cloning试剂盒购自南京诺维赞生物科技股份有限公司；小鼠抗His⁃Tag单克隆抗体及HRP标记的山羊抗小鼠IgG 均购自美国Proteintech Group 公司；Al⁃exa Fluor 488 偶联抗体购自美国 Abcam 公司；LB 培养基及IPTG 均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；ECL 发光液、超滤管（100 KDa）、0.45 μm 滤膜及PVDF膜均购自美国Millipore公司；SDS⁃PAGE蛋白上样缓冲液（5 ×）购自上海碧云天生物技术有限公司；福流纳米流式仪购自厦门福流生物科技有限公司。

1.3 重组表达质粒的构建 将载体pET21a 经SalⅠ限制性内切酶线性化后，用One Step Cloning 试剂盒与ompC基因片段进行重组，于50 ℃孵育15 min，转化感受态E.coliDH5α，于42 ℃孵育1 min；挑选阳性菌株，送深圳华大基因股份有限公司测序。取鉴定正确菌株，用质粒抽提试剂盒提取含ompC基因的质粒，将其及esxA基因均经SalⅠ和HindⅢ双酶切后，回收载体片段及目的基因片段，以T4 DNA 连接酶于室温连接30 min；转化感受态E.coliDH5α，于42 ℃孵育1 min；挑选阳性菌株，送深圳华大基因股份有限公司测序。取鉴定正确的菌株，用质粒抽提试剂盒提取含ompC⁃esxA基因的重组表达质粒。将空载体pET21a、含ompC基因的表达质粒和含ompC⁃esxA基因的重组表达质粒分别转化感受态E.coliBL21（DE3），即为阴性对照菌、重组蛋白OmpC 重组菌和融合蛋白OmpC⁃EsxA重组菌，于42 ℃孵育1 min。

1.4 融合蛋白的表达 将3 个菌株于37 ℃振荡培养过夜；按1∶100 的比例转接至LB 培养基，继续培养3 h；加入 IPTG 至终浓度为1 mmol／L，于30 ℃诱导培养5 h；11 973 ×g离心5 min，取沉淀，进行12%SDS⁃PAGE分析。

1.5 OMV的分离 将阴性对照菌和融合蛋白OmpC⁃EsxA 重组菌按1∶100 的比例分别转接至LB 培养基，于37 ℃振荡培养过夜；加入IPTG 至终浓度1 mmol／L，于30 ℃诱导表达16 h；于4 ℃，10 775 ×g离心20 min；收集上清，经0.45 μm滤膜过滤，于4 ℃，50 000×g离心2 h；取沉淀，用PBS重悬，经100 kDa截留的超滤管浓缩，即获得OMV，取 5 μL OMV，用1 ×SDS⁃PAGE 蛋白样品缓冲液重悬，进行12% SDS⁃PAGE分析。

1.6 融合蛋白定位至OMV表面的鉴定

1.6.1 Western blot 检测 分别取阴性对照菌和融合蛋白OmpC⁃EsxA重组菌及1.5项提取的OMV各5 μL，用1 × SDS⁃PAGE 蛋白样品缓冲液重悬，经12%SDS⁃PAGE 分离后，转移至PVDF 膜，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h；加入小鼠抗His⁃Tag 单克隆抗体（1∶5 000稀释），4 ℃孵育过夜；TBST 洗涤3 次，加入HRP 标记的羊抗鼠IgG（1∶10 000 稀释），室温孵育1 h；TBST洗涤3次，ECL显色。

1.6.2 纳米流式检测 将阴性对照菌OMV 和融合蛋白OmpC⁃EsxA重组菌OMV与小鼠抗His⁃Tag单克隆抗体按1∶100比例混合，于室温孵育30 min；50 000×g离心2 h，去除多余抗体，标记Alexa Fluor 488偶联抗体；标记的样品用PBS 进行1∶1 000 稀释，用福流纳米流式仪检测OMV表面融合蛋白的荧光强度。

2 结 果

2.1 重组表达质粒的鉴定 含ompC基因的重组质粒及含ompC⁃esxA基因的重组表达质粒经测序鉴定，与目标序列完全一致，见图1（含ompC基因的重组质粒测序图略）。

图1 含ompC⁃esxA基因的重组表达质粒的测序结果Fig. 1 Sequencing results of recombinant expression plas⁃mid containing ompC⁃esxA gene

2.2 融合蛋白的鉴定 分别于相对分子质量约54 000及39 000 处可见融合蛋白OmpC⁃EsxA 及重组蛋白OmpC 目的条带（目的蛋白条带上方可见1 条相对分子质量约43 000 的非目的条带，推测可能为重组蛋白OmpC 的前体蛋白），大小与预期相符；阴性对照未见该目的蛋白条带。见图2。

图2 融合蛋白的SDS⁃PAGE分析Fig.2 SDS⁃PAGE profile of fusion protein

2.3 OMV 的鉴定 融合蛋白OmpC⁃EsxA 重组菌和阴性对照菌提取的 OMV 经 12% SDS⁃PAGE 分析，均可见多条蛋白条带，且前者总蛋白量高于后者，见图3。

图3 OMV总蛋白的SDS⁃PAGE分析Fig.3 SDS⁃PAGE profile of total protein of OMV

2.4 融合蛋白定位至OMV表面的鉴定

2.4.1 Western blot 检测 融合蛋白OmpC⁃EsxA 重组菌及其OMV 中的融合蛋白可与小鼠抗His⁃Tag 抗体发生特异性结合，且于相对分子质量约54 000 处可见特异性结合条带，大小与预期相符；阴性对照未见该条带。见图4。表明融合蛋白OmpC⁃EsxA 成功定位于OMV。

图4 OMV中融合蛋白OmpC⁃EsxA的Western blot检测Fig.4 Western blotting of fusion protein OmpC⁃EsxA of OMV

2.4.2 纳米流式检测 融合蛋白OmpC⁃EsxA 重组菌OMV可被荧光抗体标记（877／17 522个颗粒），阴性对照OMV 未被荧光抗体标记（7／14 619个颗粒），见图5。表明融合蛋白OmpC⁃EsxA成功定位至OMV表面。

图5 OMV表面融合蛋白OmpC⁃EsxA的纳米流式分析Fig.5 Analysis of fusion protein OmpC⁃EsxA of OMV sur⁃face by Flow NanoAnalyzer

3 讨 论

OMV 具有多种生物学功能，如在生理条件下，OMV 可促进细菌对营养物质的摄取；在应激条件下，OMV 可促进有毒物质包括错误折叠的蛋白、重金属、抗生素等的排出；OMV 还可促进遗传物质（如耐药基因）在细菌间的水平传播。另外，对于致病菌，OMV 可介导毒力因子向宿主细胞的传输，从而破坏宿主的防御系统，增强对宿主细胞的感染。

近年，OMV 的研究热点逐渐从产生机制及生物学功能转移至 OMV 疫苗的研发［8⁃9］。许多研究对致病菌产生的OMV 进行了抗感染试验，包括假单铜绿胞菌、沙门菌、脑膜炎球菌等革兰阴性菌，均取得较好的抗感染效果［2，10⁃11］；另外，革兰阳性菌，如金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌等产生的OMV 也具有类似的抗感染效果［12⁃14］。目前，将 OMV改造为疫苗或药物呈递载体的研究也取得了较大进展，如有研究将金黄色葡萄球菌蛋白构建为重组脂蛋白后，经E.coliOMV包裹形成疫苗，该疫苗免疫小鼠后产生了较好的抗金葡菌感染作用［15］；另有研究以E.coli外膜蛋白作为锚定蛋白将抗原定位至OMV上，常用的外膜蛋白有OmpA、ClyA、OmpW 等，均能有效呈递抗原［16⁃19］。

本研究采用E.coli表达系统表达了OmpC 与金黄色葡萄球菌EsxA 抗原的融合蛋白；提取重组菌的OMV，经Western blot 检测和福流纳米流式仪检测表明，重组的融合蛋白可以OmpC 为载体将其定位至OMV 表面。有研究证明，OmpC 及 OmpA 均是 OMV中的通道蛋白，OmpC 可替代OmpA 用于抗原呈递［20⁃21］，本研究结果也证明了该结论的可行性。综上所述，OmpC 作为蛋白平台将抗原定位至OMV 表面具有可行性，有望用于抗原呈递疫苗的研发。