流感疫苗中神经氨酸酶的温度稳定性分析

曹海丹，邱璐，赵丽佳，徐文，王敏，李汶倩，李帅

长春生物制品研究所有限责任公司，吉林 长春 130012

神经氨酸酶（neuraminidase，NA）和血凝素（hema⁃gglutinin，HA）均为流感病毒表面的关键抗原，其中，HA 是目前流感疫苗开发所用的主要抗原。但在流感研究领域，早有学者呼吁以NA为流感疫苗抗原进行针对性开发［1⁃5］。2018年，CHEN 等［6］研究发现，针对NA 产生的体液免疫应答，相比针对HA 产生的免疫应答，能更有效地保护人体不受流感侵害［7⁃8］。但现有流感疫苗接种人体后诱发NA的免疫应答（即抗体数量）效率远低于自然感染人群，因此，研究者呼吁针对NA 优化抗原表位，设计开发NA 免疫应答效率更高的流感疫苗［2，9⁃10］。

针对NA 的流感应对策略在我国同样适用。根据中国国家流感中心发布的2020年第29 周第605期中国流感监测周报，自2019年10月以来，耐药性监测显示，所有甲型H1N1 和A（H3N2）亚型流感毒株均对烷胺类药物耐药；所有A（H3N2）和B 型流感毒株均对NA 抑制剂敏感［11］。除1株甲型H1N1毒株对NA 抑制剂的敏感性高度降低，其余甲型H1N1 毒株均对NA 抑制剂敏感。而且，相比HA 的高度变异特性，NA 的变异程度要明显降低［12⁃13］。据此推测，NA 所引起的特异性免疫应答，很可能帮助人体抵御绝大多数流感病毒毒株的侵害，从而起到广谱抗流感作用。因此，流感疫苗中NA 的有效抗原含量（活性）对疫苗抗流感效果有较大影响［14］。

近年来，我国流感疫苗生产工艺和质量均有大幅优化，疫苗保质期也长达18 个月。但在基层卫生工作实践中，遇各种自然或人为突发情况，疫苗保存条件可能无法保证，因此，疫苗的温度稳定性是关键指标。已有研究者检测了疫苗中HA 抗原在不同温度条件下的稳定性［15⁃17］，但我国学者对国产疫苗NA的温度稳定性研究较少。

本研究结合卫生实践中可能遇到的温度变化条件，开展了3 种型别流感疫苗NA 含量的温度稳定性测试，监测了疫苗单价原液样品在常规冷藏条件，室温（25 ℃）、变温（37 ℃）等条件下保存不同时间后的残余NA 含量，以期为系统了解流感疫苗中NA 的稳定性提供参考。

1 材料与方法

1.1 疫苗原液 H1N1、H3N2和B型流感疫苗单价原液为长春生物制品研究所有限责任公司疫苗六室制备。

1.2 主要试剂及仪器 胎球蛋白和HRP⁃PNA购自美国Sigma 公司；TMB 液购自北京索莱宝科技有限公司；酶标板购自美国Thermo Fisher 公司；酶标仪购自瑞士TECAN公司。

1.3 样本处理 将H1N1、H3N2和B型流感疫苗单价原液分别置4、25（室温）、37（变温）℃放置0.5、2、7、24、48 h，以4 ℃储存单价原液为对照，100 ℃放置1 h作为NA 失活的阳性对照。处理后的样品放回4 ℃，所有样品统一检测。

1.4 NA 活性测定 采用酶连凝集素法，参考本单位先前方法，略有改动［18］。将胎球蛋白用0.05 mol／L碳酸盐缓冲液（pH 9.6）稀释至25 μg／mL，加入酶标板中，100 μL／孔，用密封膜包裹，4 ℃过夜；次日弃上清，用洗液（100 mL 0.15 mol／L pH 7.2 的磷酸盐缓冲液加入 50 μL 吐温 20）洗涤3 次，加入倍比稀释的疫苗单价原液样品，100 μL／孔，每个样品设双孔，最后一排前两孔加入0.01 mol／L 磷酸盐缓冲液（pH 7.2）100 μL作为阴性对照，37 ℃孵育16～18 h；用洗液洗涤3次，加入HRP⁃PNA（用酶稀释液稀释至1∶500），100 μL／孔，37 ℃孵育2 h；用洗液洗涤5次，加入TMB 底物液100 μL，室温作用15 min；加入终止液 1 mol／L 盐酸溶液 100 μL，10 min 内于酶标仪波长450 nm 处测定吸光度值（A）。以待测样品A450值 ≥阴性对照A450值的2.1 倍作为Cutoff 值，确定单价原液的酶活性。阴性对照A450值≤0.1，样品A450均值 × 90% ≤A450值 ≤A450均值 × 110%判为试验结果有效。

1.5 统计学分析 应用统计学软件Graphpad Prism v 8.0 对3种疫苗在不同温度下储存的NA活性数据进行统计分析，组间比较使用双尾t⁃test检验，以变化倍数超过1.2 或小于0.8 为有差异，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NA 热变性的系统验证 经100 ℃极端高温处理疫苗原液后，H1N1、H3N2、B 型流感疫苗中 NA 活性均明显降低，且差异均有统计学意义（t分别为23.482、35.750 和 43.299，P分别为 1.95 E⁃05、3.65 E⁃06和1.70 E⁃06），见图1。表明本研究所用检测系统可检测到温度导致的NA活性变化。

图1 3 种型别流感疫苗单价原液经100 ℃处理后的NA活性Fig.1 NA activities of monovalent bulks of three types of influenza vaccines after storage at 100 ℃

2.2 3 种疫苗在常见升温条件下的NA 活性变化H1N1 型疫苗中的NA 活性在4 ℃条件下无显著变化，而在25 和37 ℃下，NA 活性均随处理时间的延长而显著下降；相比之下，在48 h处理范围内，H3N2和B 型疫苗中的NA 活性均无明显下降。见图2、表1~表3。表明在本研究条件下，H3N2 和B 型疫苗中的NA比H1N1型疫苗更为稳定。

表1 H1N1型疫苗不同处理条件下的NA活性变化Tab.1 Change of NA activity of H1N1 vaccine at different temperatures for various hours

表3 B型疫苗不同处理条件下的NA活性变化Tab.3 Change of NA activity of B vaccine at different temperatures for various hours

图2 3种疫苗中NA活性在不同温度下随处理时间的变化Fig.2 Changes of NA activities of three influenza vaccines at different temperatures with time for storage

表2 H3N2型疫苗不同处理条件下的NA活性变化Tab.2 Change of NA activity of H3N2 vaccine at different temperatures for various hours

3 讨论

流感病毒A 和B 型是引发季节性流感的主要病毒亚型，其中以甲1型（H1N1）、甲3型（H3N2）和B型为主。流感疫苗注射入人体内，引发免疫系统针对HA 或 NA 抗原产生免疫反应，产生中和型抗体［19⁃21］。因此，疫苗中的HA、NA 含量或活性对疫苗的免疫效果有直接影响。

目前我国流感疫苗出厂检测质检过程中，主要针对HA 含量和稳定性进行检测，而对NA 含量及稳定性尚未形成行业标准［22］；生产疫苗过程中，也少有机构或企业针对 NA 进行特异性设计［23⁃24］。对于流感疫苗中NA在不同温度下的稳定性研究，经文献检索仅发现1 篇［25］；而针对国产疫苗，尚无类似的系统研究。因此，本研究对流感疫苗单价原液中NA活性的温度稳定性进行了初步的系统探索，结果显示，甲3（A，H3N2）和乙型（B）流感疫苗中的NA 抗原含量具有很好的温度稳定性，37 ℃热处理48 h 后仍无明显降低；相比之下，甲1 型（A，H1N1）流感疫苗中的NA 含量在25 和37 ℃处理条件下均表现出随温度下降的趋势。本研究为系统了解流感疫苗中NA 的稳定性提供了参考，有助于日后开发和制定相关工艺标准，亦可帮助基层卫生人员合理评估疫苗保质期，节约卫生成本。基于已有结果，在流感高发季节组合配比多价疫苗时，可尝试根据当季流行毒株型别，适当调整对应单价疫苗病毒的比例，从而保证即便遇到异常储存情况也能保证足够的活性免疫原含量。后续将利用小鼠等动物模型，研究不同货架保存期或不同温度处理条件下疫苗所诱导的流感病毒NA抗体滴度，以进一步升级改善流感疫苗功效。