肠道微生态调节剂影响类风湿关节炎患者肠道微生物组和免疫微环境的临床研究

王 婵，王俊华，左 薇，许明军，张 刚

(湖北省十堰市太和医院，湖北医药学院附属医院针灸科，湖北 十堰 442000)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种炎症性自身免疫性疾病，其特征是滑膜炎和骨破坏[1-2]。微生物感染被认为是RA最重要的诱因[3-4]。RA多见于女性，男女比例约为1∶3，多发生在20～55岁之间。人类肠道微生物组很复杂，它们不仅参与食物的消化和吸收，而且在调节宿主的免疫和新陈代谢方面也发挥着重要作用[5-7]。肠道微生物组紊乱会导致微生物代谢物的变化和肠黏膜通透性增加[8-9]。这些通常会破坏非自身抗原耐受性和免疫之间的平衡，这可能会促进抗原吸收并增加免疫介导的疾病(如RA)的持续性或恶化[10-12]。微生态调节剂是根据微生态学原理，利用对宿主有益的正常微生物、其代谢产物或生长促进物质所制成的制剂，通过酶作用、抗菌、黏附定殖及生物屏障等作用来调整和保持微生态平衡，改善宿主的健康状态[13-15]。微生态调节剂主要包括益生菌、益生元，以及益生菌与益生元的混合制剂合生元等[16]。本研究旨在探究肠道微生态调节剂对RA患者肠道微生物组和免疫微环境的影响。

1 资 料 与 方 法

1.1一般资料 选择2019年7月—2021年7月在我院就诊的90 RA患者，随机分为2组：对照组(口服甲氨蝶呤片治疗，n=45)和观察组(肠道微生态调节剂治疗，n=45)，2组患者均连续治疗3个月。入组标准：性别不限，年龄18～60岁；受试者均为RA患者初治者，现在及入组前均未应用糖皮质激素；28个关节疾病活动评分-红细胞沉降率(disease activity score 28-erythrocyte sedimentation rate,DAS28-ESR)≥2.6。排除标准：食物过敏或不耐受患者；无法理解信息患者；其他严重疾病患者；怀孕和哺乳患者。2组患者一般临床资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。

本研究已经获得医院医学伦理委员会批准，且所有患者参与研究前被告知研究目的并签署知情同意书。

表1 患者一般资料统计Table 1 Statistics of general data of patients

1.2方法 对照组(口服甲氨蝶呤片治疗，n=45)：口服成人5～10 mg/次， 1次/d，每周1～2次，患者均连续治疗3个月。观察组(肠道微生态调节剂治疗，n=45)：口服整肠生胶囊(东北制药集团沈阳第一制药有限公司，批号：国药准字S10950019)治疗，口服，1粒/次，3次/d，5 d为一个疗程，患者均连续治疗3个月。

1.3观察指标

1.3.1肠道微生物组多样性检测 DNA提取和PCR扩增：解冻的肠道样品最初在提取缓冲液中用手持杵和研钵研磨，然后通过添加陶瓷和二氧化硅颗粒的混合物有效地裂解样品。使用FastDNATM Spin Kit for Soil(MP Bio公司，美国)并按照制造商提供的方案提取总DNA。用于16S rRNA扩增的PCR热循环为：95 ℃变性3 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s 27个循环；最后在72 ℃下进行10 min的延伸步骤。

Illumina MiSeq测序：PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行检查，提取目标条带，然后使用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒(Axygen Biosciences公司，美国)进行纯化，并使用QuantiFluorTM-ST(Promega公司，美国)进行定量。汇集来自每个cDNA文库的等摩尔浓度的纯化扩增子，并使用Illumina MiSeq平台(上海Majorbio公司)进行测序(2×250 bp)。所有数据都进行了正态性(Shapiro-Wilk检验)和同质性(O′Brien检验)测试。使用JMPTM软件(SAS 公司，美国)分析数据，使用R计算Chao1的丰富度指数以及Simpson和Shannon多样性指数。

1.3.2酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA) 收集患者血样，使用ELISA试剂盒(RayBiotech Norcross公司，美国)测定IgG、IgM和IgA水平，并使用Biotek Synergy HTX酶标仪或自动液体处理器(Dynex Technologies，美国)在450 nm处读取板。

1.3.3病残分级 功能活动分为4级，Ⅰ级：关节功能完整，一般活动无障碍。Ⅱ级：有关节不适或障碍，但尚能完成一般活动。Ⅲ级：功能活动明显受限，但大部分生活可自理。Ⅳ级：生活不能自理或卧床。

1.3.42组治疗效果的比较 患者采取治疗后，关节肿胀、疼痛的症状完全消失，关节活动度恢复正常，日常生活不受影响，表示治疗痊愈；患者治疗后，关节肿胀、疼痛等症状明显改善，关节活动度基本恢复到正常水平，随着天气变化会感到轻微疼痛，表示治疗有效；患者治疗后，关节肿胀、关节疼痛有一定改善，关节活动度恢复一部分，表示治疗好转；患者治疗后，关节肿胀、关节疼痛无改善，甚至加重，关节活动度受限严重，患者日常生活受到极大影响，表示治疗无效。

1.3.5疾病活动度评分 使用C反应蛋白(C reactive protein，CRP)的DAS28-ESR和DAS28综合评分包括28个关节中压痛和肿胀关节的数量、患者在视觉模拟量表(visual analogue scale,VAS)上对其总体健康状况的估计，以及ESR或CRP。DAS28-ESR计算为0.56×(压痛关节数)+ 0.28 × (肿胀关节数)+0.7×ln ESR+0.014×VAS(31)。DAS28-CRP计算为0.56×(压痛关节数)+0.28×(肿胀关节数)+0.36×ln(CRP+1)+0.014×VAS+0.96。为了检查参与者对饮食治疗的反应如何，使用了欧洲抗风湿病联盟(European alliance against Rheumatism，EULAR)临床试验反应标准。无效定义为治疗后DAS28-ESR降低≤0.6单位，或>0.6至≤1.2单位且DAS28>5.1。有效定义为降低>0.6至≤1.2单位与DAS28≤5.1或降低>1.2单位与DAS28>3.2组合。显效定义为减少>1.2单位，同时DAS28≤3.2。

1.4统计学方法 应用SPSS 20.0统计软件分析数据。计量资料比较采用独立样本t检验和配对t检验；计数资料组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.12组治疗前后肠道微生物组多样性 治疗前2组患者的微生物组菌群均匀度和微生物组菌群丰富度比较差异无统计学意义(P>0.05)，治疗后，两组患者微生物组菌群均匀度和微生物组菌群丰富度较治疗前升高，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后，观察组微生物组菌群均匀度和微生物组菌群丰富度较对照组升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组治疗前后肠道微生物组多样性Table 2 Intestinal microbiome diversity of the two groups before and after treatment

2.22组治疗前后免疫功能指标 治疗前2组患者IgA、IgM和IgG比较差异无统计学意义(P>0.05)，治疗后，2组患者IgA、IgM和IgG较治疗前升高，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后，观察组IgA、IgM和IgG较对照组升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 2组治疗前后免疫功能指标Table 3 Immune function indexes of the two groups before and after treatment

2.3病残分级 治疗前2组患者的Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级患者比例比较差异无统计学意义(P>0.05)，治疗后，2组患者Ⅰ级和Ⅱ级患者比例较治疗前升高，Ⅲ级和Ⅳ级患者比例较治疗前降低(P<0.05)。治疗后，观察组Ⅰ级和Ⅱ级患者比例较对照组升高，Ⅲ级和Ⅳ级患者比例较对照组降低(P<0.05)，见表4。

表4 2组病残分级Table 4 Classification of diseases and disabilities in two groups (n=45，例数，%)

2.42组治疗效果 观察组显效率和总有效率较对照组升高(P<0.05)，观察组无效率较对照组降低(P<0.05)，观察组与对照组的治疗效果的有效率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 2组治疗方法两组治疗效果Table 5 Therapeutic effect in two groups (n=45，例数，%)

2.52组疾病活动度评分比较 调查两者疾病活动度评分，观察组患者的疾病活动度评分较对照组升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表6。

表6 2组疾病活动度评分比较Table 6 Comparison of disease activity scores between two groups 分)

3 讨 论

RA的发展基于遗传和表观遗传学，但环境因素也起着重要作用，例如香烟烟雾和灰尘接触，尤其是代表“内部”环境的微生物组[17]。RA的易感性与环境因素有关，例如吸烟和感染，这可能由肠道微生物组介导。特别是，基因型和性别是肠道微生物组的重要决定因素，尽管肠道微生物组会随着年龄而动态变化[18]。肠道微生物组多样性的减少是RA发生的原因之一[19]。早期RA患者肠道微生物组的组成发生了变化，双歧杆菌和拟杆菌属中某些细菌的丰度降低，普氏菌属增加。在无菌模型中，肠外注射外源性肠道细菌细胞壁碎片可诱发关节炎。临床RA患者的部分肠道微生物组在抗风湿治疗后恢复正常。饮食会影响炎症的活动，高脂肪饮食对肠道通透性有负面影响[20]。RA患者粪便中肠道微生物组的α多样性指数明显低于健康人。类杆菌属和埃希菌-志贺菌属在RA患者中更为丰富肠道菌群失调与RA等自身免疫性疾病的发病有关，其在导致免疫耐受性破坏中的作用。RA的自然病程包括不同的阶段，包括有风险的症状前阶段和经典侵蚀性疾病阶段之前的早期关节炎阶段。RA临床前阶段最引人注目的参与者是自身抗体，这是RA的标志。RA相关自身抗体包括类风湿因子(rheumatoid factor，RF)、瓜氨酸蛋白抗体(anti-citrullinated protein antibody，ACPA)和抗氨基甲酰肽抗体(anti-carbamoyl peptide antibody，anti-CarP)。可以在临床明显RA发病前数年检测到高血清浓度的RF、ACPA和抗CarP。RA临床前阶段自身抗体谱的演变包括同种型转换。在高RA风险人群中，IgA-的患病率高于IgG-ACPA，表明黏膜免疫反应在疾病的临床前阶段很重要。在后来发展为RA的不同人群中，发现血清IgA-和IgM-RF的患病率高于IgG-RF，并且IgA-RF出现最早。黏膜微生物群的失调与局部自身免疫过程密切相关，早期和长期RA患者的微生物群组成均受到显着干扰。本研究显示，治疗后，2组患者IgA、IgM和IgG较治疗前升高。治疗后，观察组IgA、IgM和IgG较对照组升高。益生元是一种不易消化的食物成分，可选择性地刺激肠道中益生菌的生长和活性，从而改善宿主健康。益生菌/益生元对RA的治疗作用已在动物和人类中得到证实。本研究显示，治疗后，两组患者微生物组菌群均匀度和微生物组菌群丰富度较治疗前升高。观察组微生物组菌群均匀度和微生物组菌群丰富度较对照组升高。笔者分析认为，益生菌是活的微生物，当摄入足够量时，可以改善个体的健康情况。益生元是一组被肠道微生物群降解的营养素，支持共生体的生存。益生菌和益生元的使用会影响肠道微生物群的组成和功能。益生菌不仅通过直接免疫系统调节具有免疫调节作用，还通过调节肠道通透性和与病原体的竞争。对不同菌株的多项研究[21]，证明益生菌调节紧密连接蛋白ZO-1和occludin的表达和分布。乳酸杆菌和双歧杆菌属被认为是SCFA的生产者，导致肠道屏障功能的加强。

本研究还发现，观察组显效率和总有效率较对照组升高，观察组无效率较对照组降低，观察组与对照组的治疗效果的有效率比较差异无统计学意义。观察组患者的疾病活动度评分较对照组升高。本研究与相关研究可相互印证，一项益生菌补充剂对RA患者的疾病活动和代谢状态的影响研究显示[22]，与安慰剂相比，这组患者的DAS28、高敏CRP血清水平有所改善。另一项研究评估了每天补充干酪乳杆菌八周对RA患者疾病活动和炎性细胞因子水平的影响。L.casei补充剂导致DAS28的改善和试验结束时CRP的显着降低。此外，促炎细胞因子(如TNF、IL-6和IL-12)的水平降低，而IL-10(一种已知的抗炎细胞因子)的水平增加。

综上所述，肠道微生态调节剂通过调节RA患者肠道微生物组和免疫微环境，能够有效控制RA患者疾病活动的发生发展，是一种安全有效的治疗方法。