河北省保定市HIV-1流行重组毒株基因分布特征及独特重组毒株重组结构分析

李艳，刘洋，赵煊赫，赵静，杨学刚，安伟娜，李永勤

根据联合国人类免疫缺陷病毒(HIV)/获得性免疫缺陷综合征(AIDS)(UNAIDS)联合规划署发布的官方报告[1]，2020年全球有3 770万人感染了HIV。HIV-1具有高度的遗传变异性，导致了HIV-1丰富的基因多态性，目前全球共发现了 123 种流行重组毒株(circulating recombinant form，CRF)和许多独特重组毒株(unique recombinant form， URF)(http://www.hiv.lanl.gov)。在我国，迄今已报告了24 种CRFs，由CRFs引起的HIV-1感染达到了80%以上[2]。保定市是河北省人口最多的城市，紧邻首都北京，所辖21个县、区、市(包括雄安新区三县)，自古是京畿要地，保定市艾滋病控制的成效在一定程度影响京津地区艾滋病的防控。当前，保定市是河北省艾滋病疫情最为严重的城市之一[3]。保定和石家庄报告的HIV-1感染占全省总数的37.1%[4]。本研究以保定市2019年6月-2021年12月新诊断的、未接受抗病毒治疗的296例HIV-1感染者为研究对象，进行pol区全长基因扩增测序分型，了解本地区HIV-1毒株的流行重组亚型分布情况，并对不能明确分型的样本运用近末端稀释法分两段扩增其近全长基因组序列[5]，通过系统进化树分析和重组断点分析确定其重组亚型和重组模式，为该地区艾滋病的防控提供重要的基础数据。

1 材料与方法

1.1标本来源 2019年6月-2021年12月所有在保定市疾控中心经免疫印迹实验确证血浆HIV-1抗体阳性，准备在保定市人民医院(保定市艾滋病治疗定点医院)接受抗病毒治疗的296例HIV-1感染者，所有研究对象均签署知情同意书，并经保定市人民医院伦理委员会审核同意 。

1.2逆转录-巢式PCR 逆转录-巢式PCR方法扩增HIVpol区全长基因片段(约3.1 kb)。反应引物及反应条件参考文献[6]。

1.3HIV-1近全长基因组序列扩增及测定 采用德国 QIAGEN 公司的 QIAampViral RNA Mini Kit(50)试剂盒提取病毒RNA,按试剂说明书操作；选择TaKaRa公司PrimeScript Ⅳ 1st strand cDNA Synthesis Mix使用引物 1.R3.B3R和07Rev8将RNA分别逆转录成3′和5′半分子cDNA。利用TaKaRa公司的LA Taq试剂进行巢式聚合酶链反应(PCR)扩增HIV-1的近似全长基因；与HXB2对应的引物序列和位置列于表1。两个区域的两轮扩增使用相同的扩增 条件如下：94 ℃ 3 min，然后94 ℃ 20 s，60 ℃ 15 s，68 ℃ 4.5 min，共35个循环，最后延伸68 ℃ 10 min。扩增产物用 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性产物送至北京诺赛基因组研究中心进行基因序列测定。

表1 逆转录和巢式 PCR 的引物序列和位置Tab.1 Sequence and locations of primers used in the reverse transcription and nested PCR

1.4序列分析 测序结果使用Sequencher 5.4.6软件进行序列拼接，使用Bioedit进行序列的比对和处理。将整理好的序列上传HIV database，使用HIV blast在线工具(http://www.hiv.lanl.gov/ content/sequence/BASIC_BLAST/basic_blast.html)初步分析HIV亚型，并使用MEGA 6.0软件构建NJ(Neighbor-joining)系统进化树(bootstrap值为1 000次，模型使用 Kimura two-parameter model)同步确认。使用 jpHMM (http://jpHMM.gobics.de/submission_hiv.html)在线工具分析新型重组毒株的基因结构。

2 结果

2.1人口学特征 本研究共纳入296例HIV-1感染者，pol区全长基因测序成功264例，成功率为89.19%。264例患者中，以男性(91.67%，242/264)为主、以26～49岁(63.64%，168/264)的青壮年居多、已婚(59.09%，156/264)为主，感染途径以性接触传播(97.73%,258/264)为主，其中男男同性性传播占84.47%(223/264)。

2.2HIV-1 亚型分析 根据 HIV-1 BLAST和NJ系统进化树结果，在264例新诊断的HIV-1感染者中，共发现11种HIV-1亚型，以CRF01_AE(51.89%, 137/264)、CRF07_BC(25.00%, 66/264)和B亚型(10.98%, 29/264)为主。其他几种CRFs包括CRF103_01B(1.89%, 5/264)、CRF55_01B(1.52%, 4/264)、CRF59_01B(0.38%, 1/264)、CRF65_cpx(0.76%, 2/264)、CRF68_01B(0.76%, 2/264)、CRF80_0107(0.38%, 1/264)、CRF112_01B(0.38%, 1/264)和URFs(3.41%, 9/264)。

2.35株URF的重组模式分析及鉴定 9株URF中共获得近全长基因组5个，5个HIV-1感染者均为男性，年龄在26～50岁，均为男男性行为者(men who have sex with men, MSM)，标本采集时CD4+T细胞计数在134～364个/μL，病毒载量42 000～950 000 CPs/mL 之间。根据系统进化树(图1)及RIP分析结果，筛选并采用与样本株最相近的参考株，利用SimPlot 工具进行序列相似性分析，并利用Bootscan工具进行重组断点分析，最后使用在线工具Recombinant HIV Drawing Tool绘制重组镶嵌图谱。027A是插入B亚型骨架的2个CRF01_AE片段的CRF01_AE/B重组，另外4例为CRF01_AE/CRF07_BC重组，其中BD201AQ 是插入 CRF07_BC 骨架的6个CRF01_AE 片段，BD133AQ和BD203AJ分别是插入CRF01_AE骨架的4个CRF07_BC片段，BD184AQ是插入CRF01_AE骨架的2个CRF07_BC片段，见图2～6。

图1 5条URFs的系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree of five URFs

图2 027A的重组断点分析；图3 133AQ的重组断点分析结果Fig.2 Analysis of recombination breakpoints of 027A；Fig.3 Analysis of recombination breakpoint of 133AQ

图4 203AJ的重组断点分析；图5 BD201AQ的重组断点分析Fig.4 Analysis of recombination breakpoints of 203AJ；Fig.5 Analysis of recombination breakpoints of BD201AQ

图6 184AQ的重组断点分析Fig.6 Analysis of recombination breakpoints of 184AQ

2.45个HIV-1 URF基因组的同源性分析 从HIV database下载中国区HIV-1 CRF01_AE近似全长基因序列188条(红色)，CRF07_BC亚型近似全长基因序列38条(蓝色)，B亚型近似全长基因序列58条(粉色)，使用MEGA 6.0软件构建Neighbor-Joining进化树，显示027A与CRF01_AE参考株簇聚在一起，表明027A是以CRF01_AE为骨架的重组毒株，基因距离显示，027A与来源于江苏省的性传播人群的参考序列CRF01_AE.CN.2007.07JSWX045.FJ441290的基因距离最小，为0.099。其余4条序列(201AQ、203AJ、184AQ、133AQ)与CRF01_BC参考株聚在一起，其以CRF07_BC为骨架，基因距离显示201AQ、184AQ、133AQ均与参考序列CRF07_BC.CN.GZ070087.KF250366的距离最小，分别为0.074、0.099、0.087，而203AJ与参考序列CRF07_BC.CN.1114.HQ265552基因距离最近，为0.099(图7)。

图7 5个HIV-1独特型重组毒株发的同源性(基因距离)Fig.7 Homology (gene distance) of 5 HIV-1 unique recombinant strains

3 讨论

自 1981 年发现首例HIV 以来，全球因 CRF 引起的 HIV感染率从 2000 年之前的 9.3% 急剧上升到 2015 年的22.8% 。包括中国在内的东亚是亚型间重组流行率最高的地区，2015年重组毒株比例达到80.5%[7]。在早期，中国HIV-1流行基因型主要为B′/B亚型(47.5%)、C亚型(34.3%)和CRF01_AE(9.6%)[8]。2007年以后， CRF01_AE(41.1%)逐渐增多，成为中国的主要毒株，而其他重组形式，如CRF07_BC(25.3%)和CRF08_BC(12.6%)也急剧上升，成为主要流行毒株[9]。本研究发现保定市HIV-1三种主要基因型为CRF01_AE(51.89%)、CRF07_BC(25.00%)和B亚型(10.98%,)，与河北省全省的基因亚型基本一致[10]。CRFs和URFs达到了89.02%，新型CRFs达到了7种，并且URFs达到了3.41%。多种亚型共存的现象，给双重感染创造了机会，导致新型重组毒株的出现。重要的是2020年发现于保定市的CRF103_01B毒株[11]，位列本次研究的HIV-1亚型的第4位，占到了1.89%，有明显上升的趋势。本次研究中首次发现了CRF112_01B，此亚型于2021年在北京MSM中发现，尚未见公开报道，此次在保定市的MSM人群中发现，提示HIV-1在保定和北京的MSM人群中具有紧密传播性。

本研究发现的5个URFs，具有不同的镶嵌片段，涵盖了主要的三种亚型，重组模式有两种：一种是以CRF01_AE为骨架插入B亚型的CRF01_AE/B重组，一种是以CRF07_BC为骨架插入CRF01_AE的0107重组，与河北省石家庄和邯郸CRF01_AE/CRF07_BC重组以及廊坊报道的CRF01_AE/B重组镶嵌结构不同[12-14]，说明河北省HIV-1亚型间的重组多种多样，是否存在潜在的CRF或者正在形成新的CRF，应密切注意观察。

以往对于河北省HIV-1的分子流行病学研究大多是基于pol区全长或gag区全长及pol区部分片段结构基因[6,15]，其限制性在于容易将独特型重组毒株误判为CRF01_AE、CRF07_BC等已经识别的亚型，因此常常忽略重组毒株的流行情况，低估HIV-1流行亚型的多样性。本次研究通过NFLG技术共鉴定了5株新型独特重组毒株，并对其重组模式进行了描述，提示保定地区的HIV-1具有丰富的基因多样性，而HIV-1新型重组毒株的出现可能会进一步增加HIV-1耐药和免疫逃逸等的风险[16]，提升HIV-1的防治困难。因此，分析保定市HIV-1重组毒株的流行特点，不仅有助于了解本地区HIV-1的多样性和分子特征，还能为保定市HIV-1的预防和临床治疗提供数据支持。