一起鹅源番鸭呼肠孤病毒的分离鉴定

武世珍，靖吉强，李 舫，宋莎莎

（山东畜牧兽医职业学院，山东 潍坊 261061）

山东养鹅业不断发展，取得了很大成绩。近几年来，雏鹅肝脏、脾脏出现密集性灰白色坏死灶的病例不断增多。雏鹅发病率 3 %～60 %，病死率有时达80 %，该病不断蔓延，危害较大。为了寻找病因，笔者对病鹅进行了病料采集、病原分离鉴定，并对防控措施进行了探讨，为发病鹅场有效控制该病提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

病料采集：2020年5月，山东菏泽一鹅场饲养15日龄三花鹅1 400只，地面平养，鹅群中大部分鹅精神、食欲、运动基本正常，但少数鹅缩头、闭眼，食欲下降，排黄白色稀粪，陆续死亡。该鹅群未免疫呼肠孤病毒疫苗。剖检病鹅，可见肝脏、脾脏表面有密集性灰白色坏死灶，胆囊充盈，胰腺出血，心肌及心冠脂肪出血，病程长者出现心包炎、肝周炎。采集仅有坏死灶的鹅肝脏进行病原分离鉴定。

1.2 方法

1.2.1 病料触片，美兰染色，镜检 用灭菌的剪刀剪开肝脏，用肝脏的新鲜断面做触片，干燥固定，美兰染色，用显微镜油镜检查。

1.2.2 细菌分离培养 在肝脏表面用烧红的烙刀做一烙印，用接种环从烙印中央插入肝脏取病料，分别接种鲜血琼脂培养基，尹红美兰培养基，37 ℃ 培养18 h，观察结果。

1.2.3 病毒分离培养 将鹅肝脏剪碎，按 1:4体积加灭菌生理盐水，用灭菌匀浆器匀浆，液体装入灭菌离心管，反复冻融 3次。4 ℃、10 000×g离心 30 min，吸取上清液，用细菌滤器过滤除菌。取滤液接种 10日龄鸡胚 15枚，尿囊腔接种，接种量为0.15 ml/枚。接种后，37 ℃ 恒温孵化，弃去24 h内死亡的鸡胚。每间隔6 h观察1次，孵化至第 4天，把试验接种胚冷藏保存24 h。消毒鸡胚气室部，打开鸡胚，观察胚体，收取尿囊液，记录结果。

1.2.4 病毒的血凝抑制试验 根据 GB/T 16550-2008《新城疫诊断技术》，利用收取的尿囊液做病毒的血凝及血凝抑制试验。

1.2.5 引物合成 检测鹅源呼肠孤病毒引物，根据呼肠孤病毒 σC蛋白基因设计合成，上游引物P1：5'-GCACTCTGGATCCAGTAC-3'，下游引物P2：5'-CAATGGAGAAGCGAACCG-3'，目的片段大小为 438 bp。禽流感引物参考 GB/T 18936-2020《高致病性禽流感诊断技术》，检测 M 基因，F1: 5'-TTCTAACCGAGGTCGAAAC-3'；F2:5'-AAGCGTCTACGCTGCAGTCC-3'，目的片段大小为229 bp引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.6 RT-PCR检测 按 TRIzol说明书提取病毒RNA，采用 RT-PCR技术检测呼肠孤病毒、禽流感病毒。参考DB37/T 3821-2019《鸭新型呼肠孤病毒病诊断技术规范》，反转录（RT）反应主要步骤为：在 PCR管中加入 dNTP（10 mmol/L）0.8 µl，引物 P1（20 µmol/L）0.5 µl，引物 P2（20 µmol/L）0.5 µl，RNA 5.0 µl，70 ℃ 作用5 min，然后冰浴 1～2 min，再加入 RNA酶抑制剂 （ 40 U/µl） 0.5 µl， 反 转 录 酶 M-MLV（200 U/µl）0.7 µl，5×M-MLV buffer 2 µl，混匀后 42 ℃ 30 min，95 ℃ 2 min。PCR 反应体系：10×PCR buffer 5 µl，引物 P1（20 µmo1/L）0.5 µl，引物 P2（20 µmo1/L）0.5 µl，RT 产物，5.0 µl；Taq E（5 U/µl），0.5 µl；双蒸水 38.5 µl。PCR 反应程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 20 s，55 ℃20 s，72 ℃ 30 s，共进行 30个循环；最后 72 ℃延伸 10 min。参考 GB/T 18936-2020《高致病性禽流感诊断技术》，主要步骤如下，取 2.5 µl（约250 ng）提取的 RNA，加入RT-PCR反应液中，混匀后置于 PCR仪中，循环参数为；45 ℃，45 min；94 ℃，2 min；94 ℃ 30 s、52 ℃ 45 s、68 ℃ 45 s；35个循环；最后68 ℃ 延伸8 min。

1.2.7 健康雏鹅接种试验 饲养健康鹅 20只，分成试验组和对照组，每组 10只。试验组接种10倍稀释的尿囊液0.2 ml，连续观察10 d，记录发病情况。对照组鹅注射灭菌生理盐水0.2 ml/只。

2 结果与分析

2.1 病料触片，染色，镜检

将染色后的玻片，在染色区域滴加香柏油，显微镜油镜检查，未见形状规则的细菌。

2.2 细菌分离培养

37 ℃培养 18 h，血琼脂培养基，尹红美兰培养基表面均未见细菌生长。

2.3 病毒分离培养

尿囊腔接种后，鸡胚陆续死亡，胚体不同程度的出血。尿囊液清澈，不浑浊。

2.4 病毒的血凝抑制试验

利用新城疫病毒阳性血清做 HI试验，抗体效价为0，未检测到新城疫病毒。

2.5 RT-PCR检测结果

将 PCR产物进行电泳，检测到鹅源呼肠孤病毒引物扩增出438 bp的目标片段，见图1。

图1 RT-PCR扩增鹅呼肠孤病毒基因的电泳图

将 PCR产物送上海生工进行测序。将所得序列在 NCBI数据库进行比对，比对结果表明：该序列与部分番鸭源呼肠孤病毒的核酸一致性在98 %～100 %。说明该病毒和番鸭源呼肠孤病毒的同源性较近。核酸比对结果见图2。从系统进化树可看出：本试验分离到的鹅源呼肠孤病毒与2018年在德国境内绿头野鸭体内分离到的禽呼肠孤病毒核酸同源性最远，与 2019年南京农业大学从樱桃鸭分离到的鸭源呼肠孤病毒核酸同源性较近，同 2020年中国农业大学从番鸭体内分离的呼肠孤病的核酸同源性稍远。由此可推测，呼肠孤病毒在国内鸭、鹅、番鸭和绿头鸭之间存在交互感染的趋势，其致病性和抗原变化值得关注。系统进化树见图3。禽流感病毒引物未扩增出目标片段，检测结果为阴性。

图2 核酸比对结果

图3 系统进化树

2.6 健康雏鹅接种试验

雏鹅接种后，试验组鹅逐渐出现精神沉郁，行动困难，有1只在接种后第5天死亡，剖检后可见肝脏有密集的坏死灶。病变和临床雏鹅病例的较为一致。对照组鹅无异常变化。

2.7 诊断结论

根据临床表现和实验室检测结果，该群雏鹅初步诊断为鹅源番鸭呼肠孤病毒感染。

3 讨论

呼肠孤病毒属于双链RNA病毒[1]，在自然界广泛分布[2]，致病力的有明显差异。番鸭呼肠孤病毒在福建、浙江等地造成番鸭肝脏、脾脏有灰白色坏死灶，导致免疫抑制，生长不良，瘫痪，死淘率升高[3]。

鹅源呼肠孤病毒可导致三花鹅、泰州鹅、马冈鹅、阳江鹅等品种的雏鹅发病，由于呼肠孤病毒的不断变异，近几年新分离的呼肠孤病毒导致的鹅病变与王永坤等在 2002年报道的鹅出血性坏死性肝炎有了较大的区别，病理变化出现了多样化。

鹅源番鸭呼肠孤病毒严重损伤鹅的肝脏、脾脏，导致鹅抗病力差，容易继发感染鹅大肠杆菌病、鹅沙门氏菌病等。该病四季均发，2～4周龄的雏鹅发病最重，因此，做好育雏期间的饲养管理十分重要，特别是育雏舍保温、通风和消毒。

加强种鹅检疫，对种蛋、直肠拭子中鹅源番鸭呼肠孤病毒的核酸检测，逐步净化种鹅群。避免带毒种蛋污染孵化设备，导致雏鹅早期感染。种蛋入孵前严格做好种蛋消毒；孵化场对孵化设备、场地、运输车、工作人员等严格消毒程序；鹅场进雏前对育雏舍严格消毒。

免疫接种可减少本病的发生[5]。种鹅可用当地流行株制备鹅源番鸭呼肠孤病毒灭活疫苗进行免疫，种鹅在产蛋前 6周应用油乳剂灭活苗进行免疫，1个月后再加强免疫1次。雏鹅出壳后7d可用番鸭呼肠孤疫苗（CA株）进行首次免疫，雏鹅 30日龄时可加强免疫。加大疫苗研发投入，提升免疫效果，是当前面临的重要任务。

鹅场发生该病时，饲料中添加多种维生素，用黄芪多糖、柴胡、当归、白芍、白术（炒）、茯苓、炙甘草、薄荷、生姜、夏草冬虫等中药组方治疗；同时配合敏感抗生素，防止鹅大肠杆菌等细菌的继发感染。