鸡马立克氏病防控技术研究进展

苏 帅

（山东农业大学动物科技学院，山东 泰安 271018）

马立克氏病（Marek´s disease, MD）是由鸡的马立克氏病病毒（Marek´s disease virus，MDV）引起的鸡的一种肿瘤性疾病，以淋巴细胞增生和肿瘤的形成为主要特征，以外周神经、生殖腺、脏器、免疫器官中单核细胞浸润以及由于外周神经肿瘤细胞的集聚而引起的半瘫痪或完全瘫痪为典型特征[1]。匈牙利著名的兽医病理学家马立克（Joseph Marek）在1907年首先报道了该病，英国科学家Biggs在1961年倡导开始使用马立克氏病这一名称。

上世纪 20~30年代，随着商品鸡的死亡数目的明显增加，人们开始逐步关注MD。1967年，Churchill等首次报道从接种病鸡细胞的培养物中分离到了疱疹病毒。1970年，Calnek等发现MDV可以以一种具有感染性的游离细胞形式从羽毛囊排出，由于 MDV在鸡舍环境中能够相对稳定存在，易感鸡呼吸系统接触到空气中带有病毒的灰尘或羽屑，都可以引起MD的自然传播。

直到上世纪 80年代，对 MD肿瘤细胞的 T细胞特性，肿瘤诱导的成淋巴细胞样细胞系的建立，疾病的溶细胞期和免疫抑制期的确定等研究取得了重大的科研成果。HVT与CVI988/Rispens等疫苗株的分离鉴定以及广泛使用，更使得 MD成为第一个可以用疫苗免疫的肿瘤性疾病[2]。随着 MDV不断的遗传变异，毒力不断的增强，越来越多的疫苗也随之被研制应用。疫苗免疫与病毒变异相互博弈，为了保障养禽业的健康发展，国内外专家学者一直聚焦MD的研究，尤其国内专家学者在 MD的流行变异、致病性以及免疫防控取得显著的研究进展。

1 我国鸡群MDV的流行和变异现状

禽病学专家将 MDV分为弱毒、强毒、超强毒和特超强毒 4种不同毒力的致病毒株，其引起家禽的肿瘤率以及死亡率逐渐增强，其中超强毒和特超强毒在没有免疫的鸡群能够导致 3月内全部死亡。虽然一些规模化养鸡场的发病率稍低，但很多小型养鸡场的发病鸡群死亡率高达 20 %~ 30 %，给家禽养殖业造成巨大经济损失。最新国内的报道已经证实了在我国吉林、河南、广西鸡群出现特超强毒，尤其今年上半年，蛋鸡疾病的诊断已经显示我国南方地区发生了一定程度的MD流行，经过分子生物学技术和基因组学鉴定，证实是 MD超强毒[3-4]。鉴于 MD较强的空气传播，其在国内的流行应该引起养殖业的重视。因此，我国鸡群包括部分种鸡群已经呈现毒力增强型 MDV的流行，尽管绝大部分病毒分离株是 MDV超强毒，但是通过主要致病基因序列（meq、pp38基因）分析证实 MDV特超强毒已经在国内鸡群出现。然而，对于国内 MDV特超强毒的毒力判定依然有必要进行系统的动物试验比较，尤其需要关注的是 MDV参考毒株的选择以及评价试验环境的影响。

2 养禽业对于有效防控MD的迫切需求

虽然随着疫苗的免疫，MDV的毒力呈现不断增强的趋势，但是毫无疑问疫苗免疫仍然是防治MD的最有效途径。因此，自从MDV被分离鉴定以来，相关的疫苗也由 HVT，SB1，逐渐发展成了 CVI988/Rispens。然而，CVI988/Rispens对于特超强毒甚至超强毒是不能够提供良好的免疫保护的，因此，研制免疫效果优于 CVI988/Rispens的疫苗是国内外养禽业防控 MD的迫切需求。

3 MD疫苗的应用现状与研制方向

由于 MDV毒力增强导致的严重损失，国外在上世纪 80年代开始使用 CVI988/Rispens，这也导致国外鸡群在上世纪就出现了 MDV特超强毒，而国内引入CVI988/Rispens疫苗稍晚。当前临床养殖主要是使用CVI988/Rispens疫苗免疫，但是由于疫苗种毒的来源以及传代次数均有不同，临床免疫效果也参差不齐。国内研制的一株MDV弱毒疫苗 CVTR株已经获得新兽药注册证书，具有和CVI988/Rispens相当的免疫效果，也即将在临床使用。世界范围内对于MD防控的严峻形势，促使专家学者研制 MD新型疫苗。MD一直使用的是活疫苗，虽然禽病学家研制过基因工程亚单位疫苗，但是免疫效果均不理想。因此，自 HVT以来，MD均是使用的活疫苗，HVT疫苗发明人美国Witter院士通过大量的研究证实了CVI988/Rispens对于特超强毒没有理想的免疫保护，更为重要的是利用细胞传代致弱毒力研制 MD疫苗的传统方法筛选的 10余株疫苗候选株均没有 CVI988/Rispens的免疫效果好，因此，得出了一个重要结论，利用细胞传代致弱毒力研制MD活疫苗的方法已经到达MDV生物学极限，也宣告了这种传统方法研制更好疫苗的希望比较迷茫[5]。利用基因工程技术研制 MD基因缺失疫苗提供了新的思路，研制的基因缺失疫苗具有良好的生物安全性和免疫效果。我国利用国内分离株率先成功研制了 SC9-1活疫苗，其利用细菌人工染色体技术以及同源重组技术缺失掉MDV的致病基因-meq，通过多次大规模临床试验以及不同品系鸡的评价，证实具有比 CVI988/Rispens更好的免疫效果，2019年获得新兽药证书，目前已经在临床应用[6-7]。

国内研制的基因缺失疫苗逐步取代 CVI988/Rispens疫苗是 MD疫苗使用的发展趋势。疫苗的使用在追求免疫效果的同时也越来越关注生物安全、重视疫苗免疫对于疾病的净化。

4 兼具生物安全与免疫保护优势的新型MD疫苗

利用感染性克隆技术研制MD基因缺失疫苗具有缺失基因精准、疫苗毒株稳定且更利用研制载体疫苗等显著优势，但是基因组保留有氯霉素抗性基因，制约了MD基因缺失疫苗的出口。笔者利用细胞内自然重组技术结合电转化细菌内纯化筛选的基因工程技术，敲除掉MD双基因缺失疫苗候选株中的氯霉素抗性基因，研制的MD基因缺失疫苗MDLV21株没有抗性基因，而且其基因组具有能够在细菌内稳定复制的优势，保证了原始种毒的免疫原性，为载体疫苗的研制提供便利条件，相关研究已经授权国家发明专利[8]。MDLV21株活疫苗对于海兰褐蛋鸡的生长性能没有任何影响。通过严格生物安全保障措施的动物试验证实，MDLV21株活疫苗能够对人工接种MDV超强毒的蛋鸡提供完全的免疫保护，而且体重没有降低；而人工接种 MDV超强毒的蛋鸡100%发病，剖检死亡鸡可以看到明显的肾脏、肝脏等器官肿瘤。MDLV21株活疫苗相比 CVI988/Rispens对于 MDV超强毒的免疫保护指数提高15 % 以上，免疫鸡疫苗毒向外排毒的能力下降80 %，并且显著抑制 MDV超强毒在免疫鸡体内的复制，有极大提高了疫苗的生物安全性。

HVT重组载体疫苗对于鸡群传染性法氏囊病具有理想的免疫保护效果，目前在临床已经较为广泛的应用，但是其对于 MDV的免疫保护效果欠佳。国内外还没有有效的 I型 MDV重组载体疫苗，MDLV21株活疫苗为重组载体疫苗的研制奠定了基础，凭借成熟的基因编辑技术大大提高了疫苗研制的成功几率，对于鸡群多种病毒病的综合免疫防控具有重要意义。

5 MD防控的发展趋势

疫苗接种虽然可以防止肿瘤形成和死亡发生，但并不能阻止病毒的感染复制和流行传播，因此不但不能消灭此病，还会伴随着 MD疫苗的使用导致MDV毒力不断增强，甚至呈现每20年MDV毒力增强一个级别的现象[9]。然而，这种规律受限于疫苗以及检测技术的发展。包括CVI988/Rispens在内的各种MD疫苗其自身能在鸡体内大量复制且向外排毒，并且不能够有效的阻止野毒的增殖，因此，形成疫苗毒与野毒大量共存的现象，同时由于检测技术的限制并不能准确鉴定野毒的感染，增加免疫压力促使病毒变异的几率。因此，长久的MD防控措施是理想的疫苗结合精准的检测方法，以MD的净化为最终目标。MDV基因缺失疫苗具有理想的免疫效力，其基因缺失位点同时提供了明确的与野毒鉴别区分的靶点。其中荧光定量PCR是最具应用价值的鉴别诊断方法，不但能够有效区分疫苗毒与野毒，而且通过对疫苗毒与野毒的精确定量，明确鸡群的免疫状态以及野毒感染的发病进程，对于有效阻止 MDV野毒的扩散以及保障养禽业的健康发展具有重要的应用价值。

MD是鸡群流行的“老病”，但是新的变异毒株不断出现，世界范围内蛋鸡以及部分肉鸡均需1日龄免疫 MD疫苗，随着我国肉鸡规模化养殖的快速发展，肉鸡免疫MD疫苗也逐渐普遍。因此，MD疫苗具有广阔的市场前景同时也面临严峻挑战。笔者基于我国鸡MD研究现状以及研究团队最新的研究成果，对国内外 MD的防控进行了总结，为生物制品行业提供一株具有良好效果的MD疫苗，为面对今后更强毒力的MDV提供了可行的防控思路。