甘肃地区转录因子Foxp3基因多态性与原因不明复发性流产的相关性研究①

刘 倩 李亚梅 王文第 王燕侠 毛宝宏 （甘肃省妇幼保健院科研中心，兰州 730050）

复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指妊娠28 周前发生至少3 次自然流产，发生于约1%~5%育龄期女性［1］。RSA 发病除与多种因素（如内分泌、染色体、解剖和免疫等异常）有关外，仍有50%患者发病原因未知，称为原因不明复发性流产（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）［2］。成功妊娠取决于孕妇免疫状况和对胎儿的免疫调节能力［3］。转录因子Foxp3 主要由有免疫抑制作用的Treg 表达，Treg 通过接触性抑制或产生抗炎细胞因子在维持母体对胎儿的免疫耐受性中起重要作用，而Treg 的诱导和作用发挥需要Foxp3基因稳定、持续和高表达［4］。研究表明，URSA患者蜕膜和外周血中Treg 水平降低，导致Foxp3 表达减少，并降低Treg 的抑制能力，且Foxp3 基因多态性可通过影响其功能进而影响Treg 形成［5-6］。因此，推测Foxp3 基因的单核苷酸多态性（SNPs）可能是URSA的易感基因。鉴于转录因子Foxp3 在免疫调节中的重要作用，以及不同种族基因型和等位基因频率存在差异，本研究评估了甘肃地区女性Foxp3 基因多态性及其与URSA的相关性，以期从分子水平研究URSA的发病机制，为其治疗提供新的方向。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象 收集2019 年1 月至2020 年8 月在甘肃省妇幼保健院就诊的至少有过3次流产史的甘肃籍妇女150 例作为URSA 组，URSA 诊断参考2016 年我国“复发性流产诊治的专家共识”，且经临床明确诊断［1］。纳入和排除标准：①妊娠28 周前发生至少3次自然流产；②夫妻双方染色体正常；③生殖器解剖学正常；④内分泌功能正常；⑤无血栓前状态、低纤维蛋白血症及血小板增多症；⑥ACA、β2球蛋白、抗甲状腺抗体等自身抗体阴性；⑦无乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒等传染性疾病；⑧无宫外孕、生化妊娠、计划流产、意外流产等妊娠史。对照组为同一时段于甘肃省妇幼保健院健康管理中心进行健康体检的甘肃籍女性150 例。纳入标准：①既往无自然流产、宫内生长迟缓及胎儿先天缺陷等不良孕产史；②至少有过1次正常生育史。排除标准：患有高血压、糖尿病、内分泌、系统性红斑狼疮、免疫异常等全身性或基础性疾病。所有研究对象知情同意。本研究经甘肃省妇幼保健院伦理委员会批准，并符合《赫尔辛基宣言》。两组年龄、BMI、民族、吸烟史、饮酒史差异无统计学意义（P>0.05），两组文化程度和家庭月收入差异有统计学意义（P<0.05，表1）。

表1 URSA组和对照组女性人口学和临床特征Tab.1 Demographic and clinical characteristics of URSA group and control group

1.1.2 主要试剂与仪器 血液基因组DNA 提取试剂盒（北京天根生物有限公司）；HotStarTaq（Qiagen公司）；虾碱酶（SAP，Promega 公司）；外切酶Ⅰ（EXOⅠ，Epicentre 公司）；SNaPshot Multiplex kit（ABI 公司）；分光光度计Nanodrop ND-2000（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA 提取 采集研究对象外周静脉血5 ml，置于EDTA抗凝管，按血液基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA，采用分光光度计检测DNA浓度和纯度。

1.2.2 SNaPshot SNP 分型技术进行基因分型 采用在线Primer3 软件设计引物（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）并由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列及长度见表2。PCR 反应体系（20 µl）：去离子水5 µl、2× GC-Ⅰbuffer 10 µl、

表2 Foxp3基因3个位点相应的PCR引物序列和产物长度Tab.2 Primers and PCR products length at three loci of Foxp3 gene

3.0 mmol/L Mg2+0.4 µl、0.3 mmol/L dNTP 2.4 µl、1 U HotStarTaq polymerase 0.2 µl、样本DNA 1 µl 和多重PCR 引物1µl。PCR 产物采用HotStarTaq 进行多重PCR，经SAP 和EXOⅠ纯化后采用SNaPshot Multiplex kit 进行延伸，延伸反应体系（10 µl）：5 µl SNaPshot Multiplex Kit、2 µl 纯化后多重PCR 产物、1µl 延伸引物混合物、2µl 超纯水，延伸产物SAP 纯化后采用ABI3730xl 测序仪测序，GeneMapper4.1 软件分析SNP分型结果。

1.3 统计学处理 对照组Foxp3 基因rs2232365、rs2280883 和rs3761548 位点基因型分布采用Hardy-Weinberg（HWE）平衡进行检验。组间基因型和等位基因分布频率比较采用χ2检验，基因型与RSA 的相关性采用优势比（odd ratio，OR）及95%CI表示，采用SPSS26.0 软件进行统计分析。连锁程度较高的位点采用SHEsis 软件进行单倍型构建和在线分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Foxp3 基因3 个SNPs 位点基因分型结果 HWE 平衡分析结果显示，对照组Foxp3 基因3 个SNPs 位点的基因型分布符合HWE 平衡（P>0.05），提示研究对象具有群体遗传代表性。URSA 组Foxp3 基因rs2232365 位点TT 基因型分布频率为38.0%，TC基因型为48.0%，CC基因型为14.0%，对照组rs2232365 位点TT 基因型分布频率为35.3%，TC 基因型为49.3%，CC 基因型为15.3%。URSA 组rs2280883 位点TT、TC、CC 基因型分布频率分别为61.3%、34.0%和4.7%，对照组分布频率分别为60.7%、34.0%和5.3%。URSA 组rs3761548 位点TT、GT、GG 基因型分布频率分别为4.0%、34.7%和61.3%，对照组分布频率分别为5.3%、33.3%和61.3%。URSA 组和对照组Foxp3 基因3 个SNPs 位点基因型分布频率差异均无统计学意义（P>0.05，表3）。

表3 Foxp3基因多态性和URSA发病的相关性［例（%），n=150］Tab.3 Association between Foxp3 gene polymorphism and risk of URSA［n（%），n=150］

2.2 不同遗传模式下Foxp3 基因3 个SNPs 位点基因分型结果 等位基因、显性和隐性3 种基因遗传模式下，两组Foxp3 基因rs2232365、rs2280883 和rs3761548 位点等位基因和基因型分布差异无统计学意义（P>0.05，表4）。

表4 不同遗传模式下Foxp3基因多态性与URSA发病的相关性Tab.4 Association between Foxp3 gene polymorphism and risk of URSA under different inheritance models

2.3 单倍型分析 Foxp3基因3个SNP 位点的连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）分析结果如图1所示，rs2280883 和rs3761548 两个位点存在连锁不平衡（r2=0.981，D'=1）。推测最常见的单倍型共3 种：TTG>CCT>CTG，统计分析显示，URSA 组和对照组3种单倍型分布差异均无统计学意义（P>0.05，表5）。

图1 甘肃地区人群中Foxp3基因3个SNPs的LD图Fig.1 LD of Foxp3 gene 3 SNPs in Gansu population

表5 Foxp3基因单倍型与URSA发病的相关性Tab.5 Foxp3 haplotype frequencies and their associa⁃tions with risk of URSA

3 讨论

母体免疫系统在维持整个正常妊娠过程中起重要作用，促炎和抗炎细胞因子平衡可影响RSA 易感性。成功妊娠由具有免疫抑制作用的Treg 和具有抗炎作用的Th2 型细胞因子共同主导，而促进胚胎着床和维持的Th1 型细胞因子促炎作用减弱［7］。Foxp3 是Treg 发育和发挥功能的重要转录因子，Foxp3基因缺失或蛋白表达缺陷可影响Treg功能［8］。既往研究显示，Foxp3 基因多态性与多种炎症和自身免疫性疾病有关，如多发性硬化、类风湿关节炎［9-10］。本研究主要从Foxp3基因多态性与URSA的相关性方面展开，以期为临床从分子学水平寻找URSA的发病机制提供依据。

本研究对两组基本资料统计分析显示，URSA组和对照组文化程度和家庭月收入差异有统计学意义，表明文化程度与家庭收入对URSA 发生有影响，尚需进一步研究确定其具体相关性。HE 等［11］研究显示，较低的教育水平与较高的抑郁和焦虑风险显著相关，可能由于文化程度较低的RSA 患者意识不到自己的疾病，难以遵从医嘱维持治疗。同时研究显示，低收入女性的焦虑和抑郁得分较高，经济压力可能通过内分泌系统（如促肾上腺皮质激素释放激素）等机制与不良妊娠结局相关［12］。

本研究显示，URSA 和对照组Foxp3 基因3 个多态性位点（rs2232365、rs2280883 和rs3761548）等位基因和基因型分布频率差异无统计学意义，提示这3 个位点多态性可能与甘肃地区女性URSA 发病无关。吴再归等［13］部分研究结果与本研究相悖，其研究表明rs3761548 位点携带A 等位基因和A/A 基因型的患者比C/C 基因型URSA 发生风险明显增加（OR=1.73、2.98），且rs2232365 位点G 等位基因明显增加URSA 发病风险（OR=1.61）。而FAN 等［14］对Foxp3 基因这3 个多态性位点研究结果表明，rs2232365 位点携带G 等位基因发病风险高于A 等位基因，关于rs2280883 和rs3761548 多态性位点与RSA 发病的相关性，其结论与本研究一致，均显示可能不相关。提示中国人群存在遗传异质性，可能由于纳入人群具有种族差异导致。

Foxp3 基因于2001 年被鉴定为Scurfy 小鼠的致病基因，小鼠X 染色体该基因突变可导致严重的系统性自身免疫性炎症性疾病［15］。人类Foxp3 基因突变则引起X 染色体连锁的先天性免疫缺陷综合征（简称IPEX）［16］。人类Foxp3 基因全长为1 296 bp，且由11 个不同的外显子组成，位于X 染色体小臂（Xp11.23）［17］。rs2232365 和rs3761548 这两个多态性位点位于Foxp3 基因启动子区，可通过结合特异性转录因子结合位点改变基因表达并进而改变转录起始动力学［18］。rs3761548多态性位点的AA基因型可导致与某些转录因子结合失活，如E47 和C-Myb，使Foxp3 转录缺陷表达降低，功能性CD4+CD25+Tregs 缺乏或功能异常，使母胎免疫耐受失衡而发生RSA［19］。同时研究显示，rs2232365 位点A 等位基因可与转录因子GATA-3 结合，促进体内表达Foxp3 的T 淋巴细胞转化为Th2 细胞，破坏母胎间Th1/Th2平衡导致流产［20］。rs2280883多态性位点位于Foxp3 基因的9 位内含子区，ANDRÉ 等［21］分析结果显示，rs2280883 基因多态性与特发性不孕症有关。有研究认为位于Foxp3 内含子区的突变SNP（如rs2280883）可通过生成替代剪接位点和改变RNA 加工处理过程影响Foxp3 的作用，进一步引发流产［22］。

Foxp3 基因多态性可导致免疫系统失衡并在临床上介导URSA 发生，对这些多态性的研究可能有助于更好地了解其发病机制和进展。本研究显示，Foxp3 基因rs2232365、rs2280883 和rs3761548 位点多态性可能与甘肃人群URSA 发病无关，但本研究样本量较少，且同时纳入了汉族和少数民族人群，有必要扩大样本量针对不同种族开展高质量研究进一步验证。