miR-218-5p通过靶向下调ANKRD1抑制地塞米松诱导的人成骨细胞HFOB1.19损伤

陈 晨 郑润泉 李宗玉 （中国人民解放军联勤保障部队第960医院骨科，济南 250031）

地塞米松（dexamethasone，DEX）等糖皮质激素广泛应用于临床抗炎、免疫调节等方面，但糖皮质激素的长期使用可导致糖皮质激素性骨质疏松等并发症［1］。糖皮质激素性骨质疏松是临床常见的继发性骨质疏松类型，其发病率仅次于绝经后骨质疏松和老年学骨质疏松［2］。研究表明，糖皮质激素性骨质疏松发生发展的原因在于糖皮质激素可抑制骨细胞形成，促使其凋亡［3］。目前，通过干预相关基因减少成骨细胞凋亡是研究的热点。微小RNA（miRNA）是一类参与调控细胞增殖、分化和凋亡等生命过程的小分子非编码RNA，在骨质疏松症的发生发展中发挥重要作用［4-6］。研究显示，绝经后骨质疏松症小鼠骨髓间充质干细胞中miR-218-5p 表达下调，上调miR-218-5p 可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，缓解绝经后骨质疏松症［7］。但目前miR-218-5p 对糖皮质激素引起的成骨细胞损伤的影响和机制仍不明确。Starbase 生物在线软件预测显示，锚蛋白重复域1（ANKRD1）可能是miR-218-5p的靶基因。ANKRD1 是锚定重复蛋白家族成员，参与调控细胞增殖和凋亡等过程［8-9］。有报道称，ANKRD1 在骨质疏松症患者中表达升高，可能参与调节骨骼肌细胞分化［10］。本研究以人成骨细胞HFOB1.19 为研究对象，探究miR-218-5p 对地塞米松诱导的HFOB1.19 细胞凋亡和炎症因子表达的影响，及其能否靶向调控ANKRD1 发挥作用，以期了解miR-218-5p/ANKRD1 轴对糖皮质激素性骨质疏松发生发展的影响，并为其治疗提供分子靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 人成骨细胞HFOB1.19 购自杭州仟诺生物科技有限公司；地塞米松购自美国Sigma公司；胎牛血清（FBS）购自杭州四季青；α-MEM 培养基、Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡试剂盒和二喹啉甲酸（BCA）蛋白检测试剂盒购自北京索莱宝公司；LipofectamineTM2000 试剂盒、Trizol 试剂购自美国Invitrogen公司；miR-218-5p模拟物（mimics）、模拟对照序列（miR-NC）、乱序无意义阴性序列（si-NC）、ANKRD1 小干扰RNA（si-ANKRD1）、ANKRD1 过表达载体（pcDNA-ANKRD1）、空载体（pcDNA）、ANKRD1野生型质粒（WT-ANKRD1）、突变型质粒（MUTANKRD1）及PCR 引物购自上海生工生物工程有限公司；逆转录试剂盒、PCR 试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；IL-6、IL-1β 和TNF-α 试剂盒购自南京建成生物工程研究所；兔抗人B 淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白（Bax）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）多克隆抗体购自美国Santa Cruz 公司；双荧光素酶活性检测试剂盒购自美国Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和转染 复苏HFOB1.19细胞，用含10%FBS 的α-MEM 培养基（常规培养基）培养。将对数生长期的HFOB1.19 细胞以5.0×105个/孔接种于6 孔板，利用LipofectamineTM2000 试剂盒采用脂质体法分别转染miR-NC、miR-218-5p mimics、si-NC、si-ANKRD1，共转染miR-218-5p mimics 与pc-DNA-ANKRD1、miR-218-5p mimics 与pcDNA。转染6 h后，更换培养基。再培养24 h，收集细胞备用。

1.2.2 细胞分组处理 未转染及转染后的HFOB1.19 细胞均以5.0×105个/孔接种于6 孔板。其中未转染的HFOB1.19 细胞分为对照组和DEX组，对照组细胞用常规培养基培养24 h，DEX组细胞用含10 µmol/L DEX 的培养基培养24 h［11］。转染miR-NC、miR-218-5p mimics、si-NC、si-ANKRD1，共转染miR-218-5p mimics与pcDNA-ANKRD1、miR-218-5p mimics 与pcDNA 的细胞均用含10µmol/L DEX的培养基培养24 h，并分别记为DEX+miR-NC 组、DEX+miR-218-5p 组、DEX+si-NC 组、DEX+si-ANKRD1 组、DEX+miR-218-5p+pcDNA-ANKRD1 组、DEX+miR-218-5p+pcDNA 组。培养结束后，收集各组细胞及细胞培养上清液备用。实验重复3次。

1.2.3 RT-qPCR 检测细胞中miR-218-5p 和ANKRD1 mRNA 表达 Trizol 试剂提取各组细胞总RNA，逆转录为cDNA 后，行PCR 扩增。扩增程序：95 ℃5 min；95 ℃10 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共35个循环。miR-218-5p 正向引物：5'-GATGAAGGTTTCCCACCTTGTC-3'，反向引物：5'-GACTGGGAGA‐AGTGGGTCTG-3'；U6 正向引物：5'-GCGAGATAG‐TAGCGAAGCA-3'，反向引物：5'-CGACGACGCTTC‐GCGCTCG-3'；ANKRD1 正向引物：5'-GATCGAATTCCGTGATATGCT-3'，反向引物：5'-AAACATC‐CAGGTTTCCTCCA-3'；GAPDH 正向引物：5'-CG‐CAGCATACTTAATAAACCG-3'，反向引物：5'-GGT‐GGCGAGAGTCTAAG-3'。2−ΔΔCt法计算miR-218-5p相对于U6、ANKRD1 相对于GAPDH的表达水平。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 将各组细胞用PBS溶液清洗2次，并调整细胞密度为1.0×106个/ml。取1.0 ml 细胞悬液，1 000 r/min 离心5 min，弃上清。加500 µl 结合缓冲液，混悬细胞后，分别加10 µl Annexin V-FITC 和5µl PI，室温避光孵育15 min 后，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.5 Western blot 检测Bcl-2 和Bax 蛋白表达 RIPA 试剂提取各组细胞总蛋白，BCA 法测蛋白含量，行10%SDS-PAGE 电泳。电泳后，将分离蛋白转至PVDF膜，于5%脱脂奶粉中封闭1 h。分别于Bcl-2（1∶500）、Bax（1∶500）和GAPDH（1∶1 000）一抗中4 ℃孵育过夜。再于山羊抗兔二抗（1∶2 000）中37 ℃孵育1 h。加化学发光试剂避光显影，凝胶成像系统曝光拍照，Image J软件分析蛋白条带灰度值。

1.2.6 ELISA 法检测细胞培养上清中IL-6、IL-1β和TNF-α 水平 将收集的各组细胞培养上清液以3 500 r/min 离心5 min，保留上清。分别参照IL-6、IL-1β 和TNF-α ELISA 试剂盒说明书检测其在上清中的水平。

1.2.7 双荧光素酶报告基因实验 将HFOB1.19细胞以5.0×105个/孔接种于6 孔板，LipofectamineTM2000试剂盒采用脂质体法分别共转染WT-ANKRD1与miR-NC 或miR-218-5p mimic、MUT-ANKRD1 与miR-NC 或miR-218-5p mimic。转染6 h 后，更换培养基，再培养24 h，收集细胞并裂解，检测荧光素酶活性，具体操作参照双荧光素酶活性检测试剂盒说明书。

1.3 统计学分析 采用SPSS22.0软件分析实验数据。符合正态分布的计量资料以±s表示。两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DEX 对人成骨细胞中miR-218-5p 和ANKRD1表达的影响 与对照组相比，DEX 组成骨细胞中miR-218-5p 表达水平降低（P<0.05），ANKRD1 mRNA和蛋白表达水平升高（P<0.05）。见图1。

图1 miR-218-5p和ANKRD1在DEX诱导的成骨细胞中的表达Fig.1 Expressions of miR-218-5p and ANKRD1 in DEXinduced osteoblasts

2.2 过表达miR-218-5p对DEX 诱导的人成骨细胞损伤的影响 与对照组相比，DEX 组成骨细胞凋亡率和Bax 蛋白表达升高，Bcl-2 蛋白表达降低，IL-6、IL-1β 和TNF-α 表达水平升高（P<0.05）。与DEX+miR-NC 组相比，DEX+miR-218-5p 组成骨细胞中miR-218-5p 表达升高，细胞凋亡率和Bax 蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达升高，IL-6、IL-1β和TNF-α表达水平降低（P<0.05）。见图2。

图2 过表达miR-218-5p 对DEX 诱导的人成骨细胞凋亡及炎症因子表达的影响Fig.2 Effect of overexpression of miR-218-5p on DEX-in⁃duced apoptosis and expressions of inflammatory factors in human osteoblasts

2.3 miR-218-5p靶向调控ANKRD1表达 Starbase生物在线软件预测显示，miR-218-5p 与ANKRD1 的核苷酸序列存在连续结合位点，见图3A。共转染miR-218-5p mimics与WT-ANKRD1的细胞荧光素酶活性显著低于共转染miR-NC 与WT-ANKRD1 的细胞（0.39±0.02vs1.01±0.05，t=11.527，P<0.05），而共转染miR-218-5p mimics 与MUT-ANKRD1 的细胞荧光素酶活性与共转染miR-NC与MUT-ANKRD1的细胞比较差异无统计学意义（0.99±0.04vs1.02±0.05，t=0.369，P=0.731），提示miR-218-5p 可靶向结合ANKRD1，见图3B。与转染miR-NC 的细胞相比，转染miR-218-5p mimics 的细胞中ANKRD1 蛋白表达降低（0.45±0.02vs1.01±0.05，t=18.011，P<0.05，图3C）。

图3 miR-218-5p靶向调控ANKRD1表达Fig.3 miR-218-5p target regulated expression of ANKRD1

2.4 敲减ANKRD1对DEX 诱导的人成骨细胞损伤的影响 与DEX+si-NC 组相比，DEX+si-ANKRD1组成骨细胞中ANKRD1 蛋白表达降低，细胞凋亡率和Bax 蛋白表达降低，Bcl-2 蛋白表达升高，IL-6、IL-1β和TNF-α表达水平降低（P<0.05）。见图4。

图4 敲减ANKRD1 对DEX 诱导的人成骨细胞凋亡及炎症因子表达的影响Fig.4 Effect of knockdown of ANKRD1 on DEX-induced apoptosis and expressions of inflammatory factors in human osteoblasts

2.5 过表达ANKRD1 逆转过表达miR-218-5p 对DEX 诱导的人成骨细胞损伤的影响 与DEX+miR-218-5p+pcDNA 组相比，DEX+miR-218-5p+pcDNAANKRD1 组成骨细胞中ANKRD1 蛋白表达升高，细胞凋亡率和Bax 蛋白表达升高，Bcl-2 蛋白表达降低，IL-6、IL-1β 和TNF-α 表达水平升高（P<0.05）。见图5。

图5 过表达ANKRD1 逆转过表达miR-218-5p 对DEX诱导的人成骨细胞凋亡和炎症因子表达的影响Fig.5 Overexpression of ANKRD1 reversed the effect of overexpression of miR-218-5p on DEX-induced apoptosis and expressions of inflammatory factors in human osteoblasts

3 讨论

糖皮质激素在临床中广泛应用，但具有较多不良反应，如导致骨质疏松、股骨头坏死等疾病的发生［12］。目前认为糖皮质激素对成骨细胞活性的抑制和凋亡的促进作用是糖皮质激素性骨质疏松的主要病因之一［13］。因此，抑制糖皮质激素诱导的成骨细胞凋亡对于治疗糖皮质激素性骨质疏松具有积极作用。地塞米松是常用的治疗炎症性、自身免疫性疾病的糖皮质激素类药物，长期使用可引起骨质疏松，甚至骨坏死［14］。本研究显示，地塞米松可促进成骨细胞凋亡及炎症因子IL-6、IL-1β 和TNF-α表达，与既往研究结果一致［3］。提示地塞米松诱导的成骨细胞损伤模型建立成功。

miRNA 参与调控细胞增殖和凋亡等过程，与人类多种疾病的发生发展密切相关。研究已表明，多种miRNAs 参与调控成骨细胞、破骨细胞的增殖活性及凋亡，在骨质疏松的发生发展中发挥重要作用。ZHUANG 等［15］研究显示，抑制miR-107 可靶向上调CAB39 并激活AMPK-Nrf2 信号保护成骨细胞免受地塞米松诱导的氧化损伤和细胞毒性；QU等［16］研究显示，miR-218 通过抑制p38MAPK-c-Fos-NFATc1 通路抑制破骨细胞的生成和骨吸收，可作为骨质疏松症治疗的潜在分子靶点；LI 等［17］研究显示，miR-22 可通过靶向抑制Sirtuin 1 表达来加剧地塞米松诱导的成骨细胞损伤，miR-22 可能是糖皮质激素性骨质疏松的潜在治疗靶点。

本研究显示，地塞米松可抑制成骨细胞中miR-218-5p 表达，提示miR-218-5p 可能参与地塞米松诱导的成骨细胞损伤过程；过表达miR-218-5p 降低了地塞米松诱导的成骨细胞凋亡率，说明过表达miR-218-5p 可减少地塞米松诱导的成骨细胞凋亡。细胞凋亡受多种基因分子调控，其中Bax/Bcl-2 在细胞凋亡中发挥重要作用。Bax 是促凋亡分子，其表达增加可形成同源二聚体，改变线粒体膜通透性，导致细胞色素C释放量增加，进而诱导细胞凋亡；Bcl-2是抗凋亡分子，其表达增加时与Bax 形成异源二聚体，减弱Bax 的促凋亡作用［18-19］。本研究显示，过表达miR-218-5p 抑制了地塞米松诱导的成骨细胞中Bax 蛋白表达，促进了Bcl-2 蛋白表达，提示过表达miR-218-5p 可能通过调控Bax/Bcl-2 来抑制地塞米松诱导的成骨细胞凋亡。

近年来，临床和实验室研究均表明，过量的炎症因子如IL-6、IL-1β 和TNF-α 可损伤成骨细胞炎症浸润，进而引起其凋亡，是骨质疏松症发病的重要因素之一［20］。报道称，骨质疏松患者血清中IL-1、IL-6 和TNF-α 水平明显升高，经治疗后其表达水平降低，这些炎症因子参与骨质疏松的发展进程［21］。本研究显示，过表达miR-218-5p 可抑制地塞米松诱导的成骨细胞表达IL-6、IL-1β 和TNF-α，提示过表达miR-218-5p 可降低地塞米松诱导的成骨细胞炎症损伤。

为进一步探究过表达miR-218-5p 减轻地塞米松诱导的成骨细胞损伤的影响机制，本研究首先利用双荧光素酶报告基因实验证实了miR-218-5p 可靶向结合ANKRD1；同时，过表达miR-218-5p 抑制了成骨细胞凋中ANKRD1 表达，进一步说明miR-218-5p 可靶向结合并负调控ANKRD1 表达。本研究显示，地塞米松可促进成骨细胞中ANKRD1 表达，而敲减ANKRD1 减少了地塞米松诱导的成骨细胞凋亡及炎症因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 表达，说明敲减ANKRD1 可减轻地塞米松诱导的成骨细胞损伤。本研究还显示，过表达ANKRD1 可部分逆转过表达miR-218-5p 对地塞米松诱导的成骨细胞凋亡及炎症因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 表达的抑制作用，提示miR-218-5p 通过靶向负调控ANKRD1 来减轻地塞米松诱导的成骨细胞损伤。

综上，地塞米松可抑制成骨细胞中miR-218-5p表达，过表达miR-218-5p 可有效抑制地塞米松诱导的成骨细胞凋亡及炎症因子表达，减轻成骨细胞损伤，其作用机制可能与靶向下调ANKRD1 有关，miR-218-5p/ANKRD1 轴可能为糖皮质激素性骨质疏松的治疗提供新的分子靶点。