内蒙古二连浩特地区蒙古族Rh血型基因调查*

王云华 乔姝 吕瑞虹

目前血型抗原常指人类红细胞表面特异性抗原，由已鉴定的血型基因位点遗传多态性引起的遗传特征。对血型系统的研究在输血安全与新生儿溶血症等方面具有重要意义[1]。复杂、多态性是Rh血型系统的特点。因红细胞膜上Rh 复合物具有多样性，形成具有多种强抗原性的Rh 血型抗原表位，其检验临床意义仅次于ABO 血型系统[2-3]。在Rh血型系统中，D 抗原的检测早在2000 年就已被列为临床输血前的常规检查项目。而尚未对Rh 血型系统C、c、E、e 抗原有要求。故极易使受血者产生特异性抗体，继而发生溶血性反应等严重不良事件[4-5]。研究表明Rh 血型系统抗原的不匹配输注导致免疫产生，其产生的抗体对临床输血造成影响[6]。

内蒙古自治区是一个多民族混居的地方，其中蒙古族广泛聚居于我国北方和西北地区，了解蒙古族Rh 血型分型及抗原分布的遗传性状，对降低临床免疫性溶血相关不良反应的发生具有重大意义。本课题对内蒙古二连浩特地区蒙古族人群血液样本采用荧光PCR 法进行RhCE 血型基因分型并做统计学分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收取2020 年3-6 月在内蒙古二连浩特市中心医院就诊的299 例蒙古族人群的血液标本。采集EDTA 抗凝静脉全血3～5 mL，使用DNA提取试剂盒提取DNA，于-20 ℃保存。本研究已经医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法 （1）仪器与试剂。人类红细胞稀有血型基因分型检测试剂盒（生产厂家：江苏中济万泰生物医药有限公司，批号：20200618）；全血DNA提取试剂盒（生产厂家：杭州博日科技股份有限公司，批号：20200602）；rTaq 酶（生产厂家：杭州博日科技股份有限公司，批号：20191101）。荧光PCR仪[生产厂家：德必碁生物科技（厦门）有限公司，型号：TBG-Q6000]；医用低速离心机（生产厂家：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，型号：Mini-10K）；台式冷冻离心机（生产厂家：日本久保田公司，型号：S700TR）；紫外分光光度计（生产厂家：美林恒通仪器有限公司，型号：SMA4000）；核酸纯化仪（生产厂家：杭州博日科技股份有限公司，型号：NPA-32P）；旋涡混匀器（生产厂家：常州金坛区白塔新宝仪器厂，型号：XH-T）。（2）基因组DNA 提取。严格按照全血DNA 提取试剂盒说明书操作：DNA 浓度稀释到40～80 ng/μL，检测OD260/OD280 为1.6～2.0，备用。（3）PCR 扩增及扩增曲线采集。将配备好的12 种红细胞血型的32 种引物混合液加入反应板中，扩增严格按照试剂盒说明书操作；反应体积设定为10 μL，反应体系每秒升温0.4 ℃，每0.5 秒采集1 次荧光值，采集温度范围为60～95 ℃。（4）结果分析。当该孔为特异性引物的Tm 值，则判定为阳性；当该孔仅为内参引物的Tm值，则判定为阴性。

1.3 观察指标 分析299 例受试者Rh 血型分布结果；分析患者C、c、E、e 抗原分布情况；分析红细胞血型系统抗原等位基因型。

1.4 统计学处理 采用SPSS 20.0 系统软件对所有数据进行分析，计数资料以率（%）表示，比较采用χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Rh 血型分布结果 应用PCR 法对299 例血液样本进行C、c、E、e 抗原的检测，共检出8 种表现型。最常见的表型为CcEe、CCee，少见的表型是CCEe、ee、CCEE、CcEE，见表1。

表1 PCR法检测299例受试者Rh血型分布结果

2.2 患者C、c、E、e 抗原分布 基因频率C 占58.70%、c 占41.30%、E 占26.92%、e 占73.08%，C、e 均相对大于c、E。本实验检出1 例稀有血型ee 占0.334%。e 抗原在该人群中分布频率最高，E抗原在该人群中分布频率最低。4 种抗原阳性分布频率依次为e＞C＞c＞E。

2.3 Hardy-Weinberg 平衡吻合度检验 本文数据中，χ2的总值为4.055，差异无统计学意义（P＞0.05），Hardy-Weinberg 吻合度较好，见表2。

表2 内蒙古地区蒙古族患者红细胞血型系统抗原等位基因型

3 讨论

Rh 血型系统的临床意义仅次于ABO 血型系统，是临床实验中重要的血型系统。本实验结果显示，表现型CcEe 比例最高。基因频率C、e 相对大于c、E，基因频率符合Hardy-Weinberg 分布规律，P＞0.05，观察值与期望值无显著差异。调查发现，青海省蒙古族Rh 表现型分析结果为CCee（34.55%）＞ccEE（25.45%）＞CcEE（23.64%）＞Ccee（14.55%）＞CCEE（9.10%）[7]。从Rh 血型系统分布及基因频率来看，不同地区的同一民族之间和不同地区不同民族之间Rh 血型分布均存在一定的差异性，内蒙古地区蒙古族血型分布有本地域的特点。

本研究未检测到CCEE 和CcEE，其属于稀有血型，尤以CCEE 最为罕见，此前国内仅有几例相关报道[8-9]，如河南某医院就诊人员Rh 血型抗原表型的分布情况分析中检出2 例[9]。在与国内相似研究的对比中发现此研究样本量较大，充分说明在人群中检出CCEE 基因型的罕见性。本研究结果显示e 基因频率出现最高，该群体极易产生抗-E 抗体，如E 抗原阴性的患者多次妊娠或多次输注E 抗原阳性血液就会产生抗-E 抗体，而临床如果不进行常规Rh 分型检测就难以避免由这种抗-E 引起的输血反应和新生儿溶血病。在引发迟发性输血反应的原因中，产生不规则抗体是主要原因之一[10-11]。临床上不规则抗体的产生多由同种异体输血、妊娠导致。对于ICU、血液科、消化科等需要反复输血的患者，随着输血次数的增加，不规则抗体产生的可能亦随之增加，这就增加了血液选择的困难[12]。Rh血型抗原具有一定的差异性，临床输血工作中了解这种差异性是必要的[13-14]。由于本次调查血液标本数量有限，但还是发现了1 例ee 阳性表型（C、c缺失）的稀有血型，所以今后将在工作中进一步加强对无偿献血者Rh 表型的检测，扩充血型库的数据量，为临床疑难输血提供更加快速、便捷、有效的服务，为患者获得安全、及时、有效的输血治疗提供保障[15]。在目前发现人类43 个红细胞血型系统中，Rh 血型系统是最具多态性的系统，在临床上起到非常重要的作用[16]。随着国家对生育调控政策的放开，多次妊娠引发的血型相关新生儿溶血病和产妇出血时临床输血需求显著提升[17-19]，Rh 血型系统抗体属于IgG 类免疫抗体，其通过胎盘屏障可以进入到胎儿体内，与胎儿红细胞上相应的抗原结合，导致疾病产生。进行Rh 系统意外抗体检测对于预防、诊断及治疗新生溶血病等其他疾病提供重要依据。调查发现二孩孕妇不规则抗体筛查阳性率与Rh 血型不合新生儿溶血病（Rh-HDN）发病率有关。对于产前检查的孕妇，特别对于二孩孕妇检测Rh 血型抗原更具有临床意义。因此完善不同人群之间的血型遗传多态性调查，在临床输血治疗中提供表型匹配、抗原阴性的红细胞是预防输血不良反应的有效措施，对Rh 血型同型输注具有重要意义。