宏基因组二代测序技术在社区获得性肺炎中的临床应用体会

秦睿君，王虹，李虹，李慧芳

(太原市中心医院，山西 太原 030009)

社区获得性肺炎是呼吸内科最常见的疾病，可由病原微生物、理化因素、免疫损伤、过敏、药物等多种原因引起，但临床上导致肺炎最为常见的因素仍是病原微生物感染[1-3]。自然界病原微生物多种多样，患者感染后的临床症状、影像学特征及预后千差万别，轻症可短期康复，重症则可能会导致死亡，所以尽快明确感染的病原体，做到精准治疗，始终是临床医务工作者亟待解决的问题。目前传统的检测技术包括形态学检查(涂片)、分离培养、免疫学等多种方法，但是由于耗时长、阳性率低、特异性差等原因，对于指导临床实践有很大的局限性。随着基因组学的发展，宏基因组二代测序技术(mNGS)逐渐被运用于病原体诊断中。mNGS利用高通量测序得到的数据与病原体数据库进行比对，可以在短时间内对样本进行包括病毒、细菌、真菌和寄生虫的全方位检测，从而在核酸水平上精准鉴定病原体，因此在传统检测技术难以或无法检测的病原体诊断方面具有极大的优势[4]。本研究采用回顾性分析方法，对传统培养法和mNGS进行比较，以期更好地指导临床实践。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2020年12月—2021年12月我院呼吸与危重症医学科住院治疗的26 例社区获得性肺炎患者的临床资料，其中男17 例，女9 例；重症15 例(57.7%)，平均年龄74 岁，非重症11 例(42.3%)，平均年龄60 岁；临床表现为咳嗽、咳痰及呼吸困难等呼吸疾病症状者21 例，发热者20 例；临床结局死亡5 例，治愈20 例，转院1 例。本研究过程符合我院伦理委员会要求，所有患者进行纤维支气管镜检查及高通量二代基因测序时均签署检查同意书。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：所有患者的诊断符合中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南(2016年版)中社区获得性肺炎和重症肺炎的诊断标准。社区获得性肺炎的诊断标准：第一，社区发病。第二，肺炎相关临床表现：新近出现的咳嗽、咳痰或原有呼吸道疾病症状加重，伴或不伴脓痰、胸痛、呼吸困难及咯血；发热；肺实变体征和(或)闻及湿性啰音；外周血白细胞>10×109/L或<4×109/L，伴或不伴细胞核左移。第三，胸部影像学检查显示新出现的斑片状浸润影、叶或段实变影、磨玻璃影或间质性改变，伴或不伴胸腔积液。符合第一、第三以及第二中任何1 项，并排除肺结核、无炎症性肺部肿瘤、非感染性肺间质性疾病、肺水肿、肺不张、肺栓塞、肺嗜酸粒细胞浸润症及肺血管炎等后，可建立临床诊断。重症肺炎的诊断标准：符合下列1 项主要标准或≥3 项次要标准者可诊断为重症肺炎。主要标准：需要气管插管行机械通气治疗；脓毒症休克经积极液体复苏后仍需要血管活性药物治疗。次要标准：呼吸频率≥30 次/min；氧合指数≤250 mmHg(1 mmHg≈0.133 kPa)；多肺叶浸润；意识障碍和(或)定向障碍；血尿素氮≥7.14 mmol/L；收缩压<90 mmHg，需要积极的液体复苏。

排除标准：不符合上述诊断标准的患者。

1.3 方法

根据患者病情收集其住院期间咽拭子、痰液，病情允许时行电子支气管镜检查采集肺泡灌洗液(BALF)，共计26 份，其中咽拭子3 份，痰液9 份，肺泡灌洗液14 份，采集过程符合标本采集操作流程，每份标本均分为2 份，一份常规送检我院检验科微生物室行微生物培养、鉴定，另一份外送予果生物科技(北京)有限公司行宏基因组高通量二代测序鉴定病原微生物。

1.3.1 微生物培养及鉴定

按常规方法进行分离培养，使用德国布鲁克质谱仪进行菌种鉴定，使用VITEK-2 Compact全自动细菌培养鉴定药敏分析仪(法国生物梅里埃公司)进行药敏分析，根据美国临床实验室标准协会2019年规定的标准进行试验和结果判读。

1.3.2 宏基因组高通量二代测序

标本进行无菌密封，于-20 ℃储存或干冰冷链物流运输至予果生物科技(北京)有限公司，按照DNA提取、文库构建，在Illumina平台上运行宏基因组二代测序，然后进行数据分析。首先对下机数据进行质控分析，过滤掉原始数据中低质量序列和短序列(<35 bp)，得到高质量测序数据，再运用SNAP软件去除人源序列，最后通过Burrows-Wheeler，与微生物基因组数据库进行比对，从而对序列分类、鉴定。

1.4 统计学方法

采用SPSS21.0软件包对数据进行统计学分析。计数资料以百分率(%)表示，用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 传统微生物培养和mNGS检出结果比较

共收集26 份标本，采用传统微生物培养法，获得13 份阳性报告，单病种感染9 例，混合感染4 例。检出细菌病原体包括：醋酸钙不动杆菌、铜绿假单胞菌、溶血葡萄球菌、琼氏不动杆菌、肺炎克雷伯菌；真菌病原体包括：白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、酵母样菌、构巢曲霉菌。混合感染的4 例标本分别是醋酸钙不动杆菌合并光滑念珠菌感染、肺炎克雷伯菌合并白色念珠菌感染、铜绿假单胞菌合并光滑念珠菌和白色念珠菌感染以及铜绿假单胞菌合并热带念珠菌感染。

mNGS法检出23 份阳性结果，包括细菌20 种，真菌7 种，病毒9 种以及寄生虫1 种。细菌常见检出病原体是鲍曼不动杆菌、屎肠球菌及Actinomyces graevenitzii；真菌常见检出病原体是白色念珠菌和耶氏肺孢子菌；病毒中比较常见的是人类疱疹病毒4型和1型。mNGS在绝大多数样本中(21/26)检出两种以上的病原体，细菌、病毒及真菌三者共同检出9 例。此外，3 例患者mNGS结果为阴性，其相应的传统微生物培养病原学检测同样为阴性(见表1)。

表1 传统微生物培养法和mNGS病原体检出情况比较 单位：例

2.2 传统微生物培养法和mNGS的诊断效能比较

26 例临床确诊为肺炎的患者，传统微生物培养法共检出13 份阳性，13 份阴性；mNGS共检出23 份阳性，3 份阴性。mNGS灵敏度(88.5%)高于微生物培养灵敏度(50.0%)，差异有统计学意义(P=0.007)(见表2)。另外，重症肺炎患者mNGS(93.3%)和微生物培养(60.0%)的敏感性均高于非重症患者组(81.8%，36.4%)。

表2 两种方法病原体检出阳性情况比较 单位：例

2.3 典型病例

病例1，男性，78 岁，主因“血糖升高3年，发热2 d”收住我院内分泌科。既往有冠状动脉粥样硬化性心脏病病史20 余年。入院后体温波动于38.5℃～39.8℃，胸部CT示右肺上叶后段、下叶感染性病变，部分实变，先后给予头孢他啶、左氧氟沙星、美罗培南等抗生素治疗，治疗1 周后体温无下降，遂转入我科继续治疗。我们考虑到患者高龄，病情危重，故给予全面覆盖抗球菌、杆菌、病毒的治疗方案(美罗培南、万古霉素和奥司他韦)，同时行支气管镜检查，将肺泡灌洗液送检mNGS，2 d后结果回报检出病原体Actinomyces graevenitzii，序列数为358 条，同时检出鹦鹉热衣原体，序列数为183 条，两者置信度都判读为高。结合患者临床资料，该患者最终诊断为鹦鹉热衣原体肺炎，遂将治疗方案调整为多西环素治疗，1 周后患者治愈出院。

病例2，男性，50 岁，主因“间断咳嗽、咳痰1个月，加重伴气紧15 d”入院。既往体健，胸部CT示两肺弥漫性磨玻璃渗出，入院后患者呼吸困难明显，氧合指数102，给予经鼻高流量氧治疗，血氧浓度波动于75%～82%，考虑患者病情危重，经验性给予美罗培南、万古霉素、更昔洛韦和氟康唑治疗，后化验回报患者人类免疫缺陷病毒(HIV)可疑阳性，遂联合复方磺胺甲噁唑治疗，为达到精准治疗，将痰液送检mNGS，2 d后结果回报病原体为人型支原体，序列数2 055 条，耶氏肺孢子菌，序列数6 595 条，白色念珠菌，序列数666 条，三者置信度都判读为高；人巨细胞病毒，序列数14 条，人类免疫缺陷病毒Ⅰ型，序列数3 条，两者置信度都判读为中。结合患者临床资料，最终诊断为HIV，耶氏肺孢子菌肺炎同时合并支原体、白色念珠菌、人巨细胞病毒感染，遂将治疗方案降阶梯，给予复方磺胺甲噁唑、氟康唑和更昔洛韦治疗，患者治愈出院。

3 讨 论

社区获得性肺炎是最常见的呼吸系统疾病，由于环境污染、人口老龄化、伴有基础疾病以及免疫功能低下等多种原因导致其发病率、病死率居高不下，特别是重症肺炎，病死率极高。如何尽快明确病原体，由经验治疗转为精准治疗，始终是临床工作中的难题。临床通常依靠传统的微生物培养法明确病原体，但是该类检查方法检出率低，耗时长，特别是对于危重患者，经常难以获得合格的标本，微生物培养阳性率更低，阳性结果的参考价值也同样降低。随着生物技术的不断发展，mNGS技术越来越多地运用于呼吸道感染疾病的诊治中。由于它的高时效、高检出率，可以在短时间内无偏倚地对标本中全部核酸信息进行测序，因此在明确感染病原体方面有着明显的优势。2018年，加利福尼亚大学Langelier等[5]评估mNGS检测下呼吸道感染病原菌的能力，基于致病菌核酸序列、气道微生物组、宿主表达基因3个层面，成功在26 例下呼吸道感染患者中检测出全部38 种致病病原体以及升高10倍以上的气道微生物，实现对下呼吸道感染的准确诊断，也为有效区分定植菌与致病菌提供了参考。同年，Miao等[6]发表了迄今中国mNGS临床应用样本量最大的回顾性研究：共纳入511 份标本，其中包括感染病例347 例，非感染病例119 例和未明确病例45 例。结果显示，mNGS诊断肺部感染性疾病的灵敏度和特异度分别为50.7%和85.7%，均优于传统培养法，尤其在结核分枝杆菌、病毒、厌氧菌和真菌检测方面优势更加明显。Shi等[7]在评估110 例可疑肺结核感染的研究中，最终临床诊断肺结核48 例，非结核感染62 例，mNGS检测灵敏度为47.92%，与X-pert (45.83%)和培养法(46.81%)相似，高于抗酸染色法(29.17%)。Li等[8]应用mNGS对20 例肺组织样本中的病原菌进行了回顾性研究，其中15 例样本中检出致病菌，涵盖了传统方法难以检出的苛养菌和厌氧菌，同时与培养法相比，mNGS检测细菌的灵敏度和特异度分别是100%和76%。Xie等[9]对178 例重症肺炎患者的回顾性研究发现，将mNGS检测结果作为辅助诊断依据调整治疗方案，可显著提高患者28 d和90 d生存率。mNGS的另一个重要特征是可以检出既往少见的、难以检测的病原体，更新了我们对特殊肺炎的认知。

本研究回顾性分析收集的26 例肺炎患者临床资料，经过统计学比较，mNGS法灵敏度及符合率均明显高于传统微生物培养法。本研究中病例1采用mNGS技术确诊鹦鹉热衣原体肺炎，并及时调整治疗方案，治愈出院。此外我们还利用mNGS技术诊断出5 例耶氏肺孢子菌肺炎，给予精准治疗后患者好转出院，进一步证明宏基因组高通量二代测序技术在诊断特殊病原体肺炎方面有极大的优势。但是在研究中我们也发现，采用mNGS检测，混合感染居多，具体是何种病原体导致发病，仍需要我们结合临床认真分析，如大部分标本中均可找到人类疱疹病毒，该病毒是一种双链DNA病毒，超过90%的成人已经被感染并有病毒抗体，其是否属于真正的致病病原体需要结合临床等多种资料共同分析。此外还有1 例病例，mNGS技术检出毛霉菌，序列数仅为1，置信度为中，但患者以咳嗽、咳痰、发热就诊，病情短期内快速进展，并出现咯血，虽给予抗球菌、杆菌、病毒等联合治疗，但效果差，在mNGS结果回报前即临床死亡，结合患者病史、影像等资料，最终考虑毛霉菌为致病菌。该病例也同样提示我们对于测序结果的判断必须结合临床。目前我们研究的样本量仍较少，所获取的信息有局限性，高通量测序技术在呼吸道感染疾病的应用价值仍有待进一步评估，包括结果的判读、耐药基因的检测，仍需要技术的不断改进和深入研究。