精液细胞学在男性不育实验诊断中的应用价值

袁长巍，于化洲，徐阳，曹兴午

(1.北京美中宜和北三环妇儿医院，北京 100088；2.中日友好医院，北京 100029)

精子的发生、发展有其特殊性和复杂性，易受各种有害因素影响，而诊断和治疗睾丸生精功能障碍的临床思维，必须从睾丸生精功能进行评估，其功能的损伤与失调对探讨男性不育的发生机制、保护男性生殖健康有重要的实际意义。精液中生精细胞的检出常常牵涉到睾丸生精功能的改变，生精功能的改变又涉及到睾丸内生精细胞的病理变化。因此，在诊断和治疗睾丸生精功能障碍的过程中，有必要了解精液中各类细胞的脱落状态(有无、多少、形态)以及在病理损伤中所扮演的角色。精液细胞学是男性不育实验诊断的重要检测项目，通常与精液常规、精浆生化及性激素检测等共同评估睾丸的生殖功能，并可作为无精子症类型的鉴别诊断依据。

一、精液细胞学研究现状

精液细胞学一词含义较为广泛，涵盖了精液中显微镜下可见的所有内含物，包括精子、未成熟的生精细胞、白细胞、上皮细胞、支持细胞及病原微生物等，精液中所有有形成分的检出都可以作为考证睾丸生殖功能状况和病理性损伤的有效指标。目前，精液细胞学检测仍存在较多制约其发展的问题，如缺乏统一的检测标准、对生精细胞缺乏识别能力、检测耗时耗力、经济效益较差、相关内容培训少及学习意愿不强等多方面原因，使此项检测和研究长期处于被忽视和弱化状态，几乎成为“被遗忘的角落”，与其他体液细胞学相比，发展明显滞后。伍细言等[1]对中国性学会生殖检验分会委员单位的生殖检验现状进行了调查，在75份问卷中，能进行精液细胞学检测的实验室仅有12%(9/75)，表明精液细胞学的检测仍未引起足够重视。虽然精液检查自动化、仪器设置最优化逐渐得到普及[2]，传统人工显微镜细胞形态学检查不应忽视。精液中的白细胞、生精细胞及上皮细胞多呈圆形外观，统称为“圆形细胞”，在未经染色状态下难以正确分辨。目前仍有许多基层(也包括部分大型综合医院)的检验人员将精液中的圆形细胞误认为白细胞，而且已形成了固有的惯性模式。报告成白细胞，临床医生就会认为有炎症或有病原体存在，继而进行抗生素治疗，导致误诊误治的同时也给患者带来了精神和心理负担[3]。精液中的圆形细胞并不等同于白细胞，也可能是未成熟的生精细胞，应染色加以鉴别。因此，明确区分精液中主体细胞的类别在临床诊断和治疗上起关键作用，同时也是检验人员的基本责任。如主体细胞为白细胞，需要了解是否存在病原体感染；如诊断为生精细胞，则要进一步评估睾丸的生殖功能。精液中各类细胞的检出，直接或间接反映了睾丸的生殖功能、感染及免疫状态，临床应给予重视。实验室的发展也应与时俱进，不能只停留在“圆形细胞”的报告水平，加强人员培训及质量管理是当前精液细胞学检测亟须解决的迫切问题。

二、精液细胞学的检测方法

1.检测方法：精子形态学的染色方法同样适用于生精细胞的检查，常用的染色方法包括改良巴氏染色法、Diff-Quik染色法、瑞氏-姬姆萨染色法以及HE染色法等，不同的染色方法其化学性质有所不同，染色后各类细胞的形态特征亦存在差异。瑞氏-姬姆萨染色是细胞形态的经典染色方法，主要用于血液和骨髓涂片染色。精液标本经瑞氏-姬姆萨染色后，各类细胞相应呈现不同的着色，细胞核、细胞浆以及浆内的颗粒和异物成分清晰可辨，从而达到辨别其形态特征的目的，但对于精子形态染色效果要略逊于其他染色方法。

2.检测注意事项：精液细胞学检测主要应用于无精子症患者，精子浓度正常的精液标本生精细胞检测意义有限。无精子症患者精液中内含物相对较少，将全部精液标本离心(3 000g，15 min)后进行检测能更好地反映出睾丸的真实病理状态。阅片时先在低倍镜下观察全片，对细胞的分布、数量和染色情况等做初步了解，并选择体尾交界处染色良好区域，在油镜下按“弓”字形路线进行圆形细胞的分类和计数。油镜下要把握细胞形态辨别要点，注意个体细胞与群体细胞之间的关系，并遵循“核浆兼顾，以核为主”的细胞识别原则，依胞体(大小、形状、伪足)、胞质(比例、色泽、颗粒、内容物)、胞核(大小、数量、形态、位置)、染色质结构及核膜形态、核仁(有无、数量、大小)的顺序，从外向内逐步分析[4]。无精子症患者精液中，生精细胞形态多不规则，千变万化，增加了辨别难度，比如淋巴细胞与精原细胞、巨噬细胞与异常初级精母细胞、凋亡中性粒细胞与精子细胞的辨别容易相互混淆。形态学判断具有主观性，难免会出现认知偏差，所以，检验人员应熟悉各类细胞形态特点及变化规律，并结合病史及相关检查综合分析，做到相互印证，以获得正确的结论。细胞学报告以客观描述为主，应遵循看到什么、考虑什么、建议什么的报告模式，对于特殊的病例应加强实验室与临床的有效沟通，一名优秀的形态学检验人员应该具有扎实的临床医学知识，有充实的理论做指导，才能不断完善形态学诊断实践。

三、精液细胞学检测的临床意义

睾丸生精功能障碍是指因各种原因导致睾丸内生精上皮(或生精组织)生精能力下降，生精细胞部分或全部发育阻滞，导致少精子或无精子，从而不容易正常受孕[5]。当睾丸受到各种有害因素影响或发生自身固有改变时，生精小管内的各类细胞将可能由生理性改变向病理性发展。由于睾丸受损的时间、程度及导致受损的因素不同，其生精细胞的病理性改变、脱落状态及临床表现也不尽相同，少精子症、弱精子症、畸形精子症及无精子症都可能发生。精液细胞学检测的临床意义主要体现如下几个方面。

1.评估睾丸的生殖功能：生精细胞的脱落状态反应了睾丸生理与病理的变化过程，是睾丸生精功能障碍的敏感指标。精液中生精细胞的存在异常、比例异常及形态异常，可作为衡量睾丸生殖功能的有效指标。

存在异常：精液中没有精子并不代表没有生精细胞，存在生精细胞预示输精管道是通畅的，病因可能在睾丸。本课题组对923例非梗阻性无精子症(NOA)患者进行了精液细胞学检查，精子和生精细胞的检出率分别为20.04%和64.46%(数据未发表)，这为NOA患者睾丸功能评估、后续治疗及辅助生殖技术的选择提供了重要信息。如果精液中没有精子，也没有生精细胞和支持细胞，则要结合患者的体格检查、睾丸体积、生殖激素、精浆生化、超声等检测进行无精子症类型及梗阻部位的确定。同时，精液生精细胞检查联合精浆果糖及中性α-葡糖苷酶检测可有效避免有侵袭性的输精管造影[6]。

比例异常：精原细胞分化成精子是一个连续过程，如果生精细胞在某个阶段发生中断，将会导致生精细胞分化障碍，导致生精阻滞，临床上常表现为少精子症(部分阻滞)或无精子症(完全阻滞)。根据精液中各阶段生精细胞脱落的数量、比例可大致判断生精阻滞的类型。如果精液中一种或两种生精细胞比例增高，而其后阶段生精细胞减少或缺失，则要考虑睾丸生精阻滞，其中初级精母细胞阻滞最为常见，精子细胞阶段次之。生精阻滞的致病机制较为复杂，有先天性和获得性因素之分，与其他类型的NOA相比，生精阻滞患者睾丸体积及血清卵泡刺激素(FSH)水平相对正常，且遗传变异发生频率更高[7-8]。生精阻滞常见于Y染色体AZFb区完全缺失或特发性无精子症，也见于一些AZFc区缺失、染色体易位的患者。近年来，一系列生精阻滞相关单基因致病突变已被发现，特别对于精母细胞阶段完全阻滞的患者，其基因异常率明显增高，且睾丸显微取精率也不甚理想[9]。如果精液中检出大量初级精母细胞、未见精子细胞和精子时，是否需要进行睾丸显微取精还值得商榷。

形态异常：生精细胞凋亡和胀亡是细胞死亡两种不同的表现类型。凋亡机制的调节失衡是许多疾病的根源，而诱发过多的生精细胞凋亡是一种病理现象，是造成睾丸生精功能障碍的重要原因。细胞凋亡的形态特征为细胞体积变小、胞质浓缩、核染色质固缩于边缘、DNA降解，最后形成多个凋亡小体而被吞噬。细胞胀亡是一种细胞膜通透性增加至细胞膜完整性破坏、DNA裂解为非特异性片段，最后细胞溶解并伴有炎症反应的细胞死亡过程，主要表现为细胞肿胀、细胞核溶解[10]。细胞凋亡与细胞胀亡可共存于同一病灶中，并可由同一刺激引起，但两者的出现与组织血供情况、刺激强度和刺激作用时间有关，血供丰富、刺激较弱、作用时间短倾向于凋亡，反之倾向于胀亡[11]。ATP水平也影响细胞死亡方式，同一刺激下细胞内ATP水平高则表现出凋亡特征，否则因缺乏能量细胞不能完成凋亡程序则转向胀亡，补充ATP后，胀亡也可能转化为凋亡形式的细胞死亡[12]。生精细胞的形态变化反映了睾丸的损伤程度，临床治疗发现，NOA精液中正常形态生精细胞的比例越高，越具备治疗价值。那么，正常形态生精细胞的检出是否与睾丸生精小管内存在微量生精灶相关？是否可作为睾丸显微取精的预测指标？仍需要进一步研究。因此，对精液中的生精细胞进行形态分类，对疗效观察和判断预后具有指导意义。

2.支持细胞检出的临床意义：睾丸支持细胞是唯一与生精细胞紧密接触的细胞，其紧密连接是构成血-睾屏障的重要组成部分，在维持生精小管微环境稳定、精子发生及调控过程中发挥着核心作用[13-14]。支持细胞是多种有毒物质的睾丸内靶细胞，如微环境的平衡被打破，支持细胞必然受到累积性影响，最终导致支持细胞萎缩、高度降低及异常脱落[15-16]。正常生育者精液中支持细胞无或极少脱落，而NOA患者中较为常见；如精液中仅检出支持细胞、未见生精细胞，则要考虑唯支持细胞综合征可能。有害因素的刺激易使支持细胞骨架发生断裂，并随精液排出体外；精液中检出支持细胞及支持细胞骨架的微管、微丝，往往提示睾丸微环境受累，损伤已威胁到支持细胞功能，而其功能的优劣将直接决定生精细胞的分化程度及精子的生成。

3.精液中白细胞的区分：精液中可以检出不同数量的白细胞，过氧化物酶染色是WHO推荐的检测方法；当白细胞浓度>1×106/ml时，可诊断为白细胞精子症(LCS)[17]。LCS的存在是生育力的一个负面预后因素，与精子浓度、精子活动力、正常形态精子率呈明显负相关[18]。白细胞对精子的影响依赖于白细胞释放活性氧(ROS)的能力和炎症反应[19]，尽管LCS与不育症发病率增加有关，但其临床意义、诊断和治疗的不确定性仍然存在。LCS仅提示生殖道炎症迹象，但并不能准确预测微生物感染。有证据表明，精液中低水平的白细胞浓度也会出现不同程度的精液质量异常，并可引起同等程度的氧化损伤[20-21]，因此认为WHO制定的浓度阈值应根据情况重新评定。由于精液中部分中性粒细胞处于活化阶段，过氧化物酶染色并不能检测到已经释放其颗粒的中性粒细胞和不含有过氧化物酶的白细胞类型，可能导致此方法计数白细胞浓度要比实际结果偏低，这可能与低水平的白细胞水平仍会导致精液质量下降存在联系。精液中不同来源的白细胞及其亚群与精液各参数之间的相关性仍不完全清楚，计数精液中总白细胞浓度并进行分类对损伤机制的探索可能更有实际意义。精液中的白细胞主要包括粒细胞(中性粒细胞、嗜酸粒细胞)、单核/巨噬细胞、淋巴细胞。免疫细胞化学法通过单克隆抗体与白细胞表面抗原特异性结合的方法进行检测，是评估精液白细胞的金标准，但该方法操作复杂、试剂成本较高，并不适合常规开展。精液细胞染色分析可有效区分精液中的生精细胞和白细胞，还可以对白细胞的类型及形态进行分析，但要求技术人员对细胞的结构及特点比较熟悉。精液中白细胞存在凋亡、活跃、坏死等不同的形态特征，其形态变化正是反映了生理性和病理性的不同。通常情况下，在急性炎症时精液中以中性粒细胞为主，细胞常表现为核膜破损、核溶解、核破碎、核退变，结构模糊等特征，有时胞浆内可见胞内菌和中毒颗粒；在慢性非特异性炎症、急性炎症恢复期时单核/巨噬细胞比例增高，胞内常见吞噬精子、细胞、病原体、颗粒、结晶、组织碎片等异物成分，这与炎症过后巨噬细胞功能激活、清扫异物功能增强有关；当淋巴细胞增多，并伴有异常淋巴出现时，则要考虑病毒、结核菌感染的可能。如果技术人员能够做到正确分辨，这将是一种简单快速、价格便宜、准确性高、指导性强、容易推广的检测方法。

另外，精液中出现大量前列腺上皮、精囊腺上皮及附睾上皮细胞则可提示附性腺的功能损伤。线索细胞、细菌、真菌及滴虫的检出则应考虑感染因素存在，建议双方治疗，避免交叉感染。生精细胞内存在包涵体，则要考虑病毒感染的可能，应给予重视。精液中大量残渣也有其临床意义，这可能与睾丸支持细胞的吞噬功能下降有关。大量上皮细胞和乳酸杆菌的检出应考虑性交后排精。

四、精液细胞学与睾丸活检

睾丸活检是男性不育症病理检查的主要方法及金标准，多年来已被临床所接受。通过病理组织学观察可直接评价睾丸的生精功能和生精障碍程度。但对于NOA患者，睾丸本身的生精状态不尽均衡，存在局部性精子发生现象，由于取材部位的局限性，单次睾丸活检可能难以全面、完整反映睾丸的整体状态，同时多点、多次的手术取材又会加重睾丸的损伤。精液细胞学检测可以反映整个睾丸功能，免除了睾丸活检带来的创伤、恐惧和不可重复性。即使睾丸组织病理诊断为唯支持细胞综合征的患者，通过精液细胞学检查仍可以检出生精细胞，甚至精子。两者在无精子症的诊断和治疗上各有利弊，应相互补充。对于睾丸生殖功能的评估，应遵循“先无创、再微创、后有创”的原则进行，并结合性激素、抑制素B、精浆生化等结果综合考量。

五、精液细胞学与性激素水平

男性不育的影响因素较多，其中性激素水平与男性不育的发生密切相关，下丘脑-垂体-睾丸轴的相互作用维持着正常男性的性激素水平和睾丸生精功能。精子发生是一个激素依赖的连续不断增生和分化的过程，任何一个环节出现平衡失调，都可能影响精子的正常发生和成熟[22]。同时检测黄体生成素(LH)、FSH及睾酮(T)的水平，对于性腺功能减退症的病因定位诊断具有重要的价值，有助于后续治疗方案的正确制定。精子发生在增殖和成熟阶段，需要自分泌、旁分泌和内分泌刺激，这是由FSH和T共同保证的。FSH主要作用于初始的几个阶段，而T作用在最后几个步骤[23]。睾丸生精功能障碍的发生，首先是睾丸支持细胞-生精小管嵌合体受损，负反馈引起FSH水平升高，继而导致Leydig细胞T分泌减少，负反馈引起LH水平随之升高[24]。血清FSH水平可反映生精小管内各级生精细胞的分化和发育程度，高浓度的FSH往往预示着整个睾丸功能的损伤，且血清FSH水平越高，生精障碍程度越严重，精子数量降低越明显[25-26]。如果同时伴有LH显著升高时，表明损伤已经累及Leydig细胞。FSH与T是保证生精细胞正常分化的必须因子，并通过Sertoli细胞进行调节，避免生精细胞过度凋亡。睾丸内生精细胞的异常脱落导致成熟精子生成受阻，是最终表现为少精子症或无精子症的重要原因。

血清LH与FSH水平不仅与精子数量的多寡呈负相关，还与生精细胞脱落的数量有着密切联系。本课题组将738例NOA患者的精液标本分为生精细胞存在组和生精细胞缺乏组，并对两组的性激素水平(LH、FSH、T)进行比较，结果发现LH、FSH水平组间比较具有统计学差异，T水平比较无统计学差异[27]。睾丸生精功能障碍的病程发展，必定有初始-受损-轻度-中度-重度的病变过程，即使精液中没有精子，生精细胞仍在继续脱落并逐渐枯竭，最终可能发展为不可逆的唯支持细胞综合征的病理表现类型。通过精液生精细胞和精子形态的检查，能够观察其精子发生、发展的各个阶段，即使唯支持细胞综合征的患者，也应该结合精液生精细胞检出的有无、多少、比例、形态来评估和预测睾丸的生精功能。根据性激素水平和精液细胞学分析结果，适时调整药物种类、剂量和给药频率，对评估和治疗睾丸生精功能障碍有着重要价值。

总之，精液细胞学检查可以更好地了解睾丸潜在的储备能力，可以对睾丸可能持续生成精子的数量和质量以及生精细胞的动态分化能力进行评估。形态学辨识是医学检验的重点内容，也是检验技术的重点和难点。精液细胞学已进入推广和应用阶段，可以在推广中探索与提高，在实践中不断地深入、丰富、纠正和完善，以期在充分发挥实验室诊断价值的同时更好地为临床服务。