基于网络药理学和分子对接预测金匮肾气丸治疗早发性卵巢功能不全的作用机制

何佳璘，杨丽雅，郭一鸣，亓明康，王含必，王慧萍*

(1.北京协和医学院研究生院，北京 100730；2.中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院妇科内分泌与生殖中心，国家妇产疾病临床医学研究中心，北京 100730；3. 国家卫生健康委科学技术研究所，国家卫健委生殖健康工程技术研究中心，北京 100081)

早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)是指女性在40岁之前卵巢活动衰退的临床综合征，以月经异常(如闭经或稀发月经)伴有高促性腺激素(FSH>25 U/L)和低雌激素为特征[1-2]。POI患者较正常女性有更高的心血管疾病发生率、骨质疏松和骨折风险，且更容易出现认知功能的下降。随着现代女性生活工作压力的增加，近年来POI的发病率呈逐年增高的趋势，据流行病学统计，POI的发病率已由1986年的1%增长到2014年的3.6%[3-4]。POI的病因主要有遗传性因素、医源性因素、环境因素、心理因素和免疫因素等[5]。目前最主要的治疗方法是激素补充治疗，但是因其有增加乳腺癌发生风险等副作用应用受限。中药作为一种相对安全有效的药物，为POI提供了另一种治疗选择。金匮肾气丸记载于张仲景的《金匮要略方论》，主要组成为：附子、桂枝、熟地黄、山药、山茱萸、茯苓、牡丹皮、泽泻。金匮肾气丸补肾化气，滋肾阴，温肾阳，临床有时用于治疗女性月经紊乱。本研究应用网络药理学方法和分子对接技术[6-7]，探讨金匮肾气丸治疗POI的潜在药物作用机制，为寻找POI新的治疗方法提供参考。

材料与方法

一、金匮肾气丸活性成分与潜在靶点的收集与筛选

使用中药系统药理学分析平台(TCMSP)，以类药性(DL)≥0.18、口服吸收利用度(OB)≥30%为金匮肾气丸中各味药材活性成分的筛选条件，这两个条件是评价ADME特征(吸收、分布、代谢和排泄)最重要的指标，通过筛选，得到金匮肾气丸的活性成分。从pubchem网站中获取活性成分化合物的简化分子线性输入系统号(SMILES)，并基于化学相似性原理利用SwissTargetPrediction[8]和SEA数据库[9]预测药物靶点。

二、POI靶点筛选

与POI相关的基因通过关键词“premature ovarian insufficiency”从公共数据库中检索下载，包括在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM)、Drugbank数据库和人类基因数据库(GeneCards)，并进行已有文本挖掘。

三、金匮肾气丸治疗POI关键靶点的分析

将活性成分预测靶点与POI的靶基因整合并取交集，得到金匮肾气丸治疗POI的潜在靶点，将所有潜在靶点导入STRING数据库，得到蛋白质-蛋白质相互作用数据。将所有潜在靶点上传到Metascape数据库[10]中，进行基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集分析。GO分析包括生物学功能分析、分子功能分析和细胞成分分析，KEGG分析可得到金匮肾气丸治疗POI的主要通路；结果均以P<0.05表示差异有统计学意义。

四、网络构建

利用cytoscape3.7.2软件构建金匮肾气丸各药材-活性成分-潜在靶点网络，蛋白质-蛋白质相互作用网络；并使用NetworkAnalyzer计算网络拓扑学参数进行网络分析。

五、分子对接

将筛选后的关键活性成分和核心靶点进行分子对接验证，从pubchem数据库中查询筛选出的关键活性成分的3D结构，从PDB数据库中下载筛选出核心靶点的3D结构，使用Pymol软件对蛋白去水去配体加氢，导入Autodock软件中进行对接寻找最佳对接位点，并将最佳构象导入Pymol进行可视化处理。

结 果

一、金匮肾气丸活性成分与靶标预测结果

在TCMSP数据库中共检索出金匮肾气丸活性成分102个，包括茯苓活性成分15个，附子活性成分21个，桂枝活性成分7个，牡丹皮活性成分11个，山药活性成分16个，山茱萸活性成分20个，熟地黄活性成分2个，泽泻活性成分10个。在SwissTargetPrediction、SEA数据库中共预测出茯苓活性成分潜在靶点143个，附子活性成分潜在靶点275个，桂枝活性成分潜在靶点62个，牡丹皮活性成分潜在靶点157个，山药活性成分潜在靶点208个，山茱萸活性成分潜在靶点247个，熟地黄活性成分潜在靶点42个，泽泻活性成分潜在靶点191个，整理后得到金匮肾气丸潜在靶点432个。

二、POI靶点和潜在治疗靶点筛选

从Drugbank、GeneCards、OMIM中检索POI，并进行相关文献文本挖掘，共得到POI相关靶点4 867个，将其中以相关性分数>25分为条件筛选得到的279个靶点与金匮肾气丸潜在靶点整理取交集后得到金匮肾气丸治疗POI的潜在靶点82个(图1)。

图1 金匮肾气丸各味药材治疗POI潜在靶点Upset图

三、GO和KEGG富集分析结果

将筛选得到的金匮肾气丸治疗POI的潜在靶点导入Metascape数据库中进行GO和KEGG分析，最终得到1 805条GO条目和263条KEGG条目，其中得到1 636条生物过程条目，主要富集在正向调整激酶活性、腺体发育、细胞对激素刺激的反应、生殖结构的发育等方面；62条细胞组分条目，主要富集在受体复合物、膜筏、转移酶复合物等方面；107条分子功能条目，主要富集在蛋白激酶活性、细胞因子受体结合、核受体活性等方面；263条通路条目，主要富集在磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、缺氧诱导因子-1(HIF-1)、肿瘤转化相关蛋白53(P53)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)、转化生长因子-β(TGF-β)等信号通路上。按照显著水平P值从小到大排列，GO分析结果分别选取生物过程、细胞组分、分子功能前10条绘制柱状图(图2)，KEGG分析结果选取前20条绘制气泡图(图3)。

BP：生物过程；CC：细胞组分；MF：分子功能。图2 金匮肾气丸治疗POI潜在靶点GO富集分析

图3 金匮肾气丸治疗POI潜在靶点KEGG富集分析

四、金匮肾气丸治疗POI潜在靶点的网络构建及网络拓扑分析

使用cytoscape3.7.2软件构建金匮肾气丸各药材-活性成分-潜在靶点网络(图4)，其中红色节点为金匮肾气丸药材成分如茯苓、附子等，黄色节点为金匮肾气丸药材活性成分如胡椒碱、薯蓣皂苷元等，蓝色节点为金匮肾气丸治疗POI的潜在活性靶点如雌激素受体等。将获得的金匮肾气丸治疗POI的潜在靶点导入STRING数据库中，并将交互信息绘制蛋白质-蛋白质相互作用网络图(PPI图，图5)，利用NetworkAnalyzer进行两个网络拓扑学分析，计算得到网络中平均最短路径、介数和自由度。具有较小平均最短路径、较大介数或较大自由度的节点视为网络中的重要靶点，图5中节点颜色随自由度值变化，颜色越红节点越重要。为综合考虑平均最短路径和介数，引入R值用于评估靶点的重要性，R值越小靶点越重要(表1)。最终确定PPI网络(图5)中R值越小且自由度为平均自由度2倍以上的蛋白靶点：雌激素受体α(ESR1)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(AKT1)为核心蛋白靶点；药材-活性成分-潜在靶点网络(图4)中自由度为平均自由度2倍以上的靶点：薯蓣皂苷元、泽泻醇B、羟基芫花素、去氧穿心莲内酯、胡椒碱、槲皮素为核心活性成分靶点。

图4 金匮肾气丸药材-活性成分-潜在靶点网络

图5 金匮肾气丸治疗POI潜在靶点PPI图

续表

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五、分子对接结果

利用分子对接技术对网络药理学结果进行进一步验证，将网络中筛选出的金匮肾气丸治疗POI的核心活性成分和核心靶点进行分子对接，结合能越低则核心活性成分与核心靶点的结合力越强，一般认为结合能≤-5.0 KJ/mol的核心活性成分与蛋白分子结合较好。根据结合能绘制热图(图6)，颜色越深表示结合能越低、结合力越强。将结合能≤-5.0 KJ/mol的构象进行可视化(图7)，结果显示薯蓣皂苷元与ESR1、VEGFA、AKT1，泽泻醇B与ESR1、AKT1，羟基芫花素与ESR1，胡椒碱与ESR1具有较强的结合力。

图6 金匮肾气丸治疗POI的核心活性成分和核心靶点结合能热图

图7 金匮肾气丸治疗POI的核心活性成分与核心靶点的分子对接图

讨 论

目前POI的治疗包括激素替代治疗、干细胞移植、中药治疗等多种方式，对于缓解症状有一定效果，但仍存在一定的局限性。以激素替代治疗为例，该治疗方法除了可能增加乳腺癌发生风险外，还存在多种应用禁忌证和慎用情况，如恶性肿瘤、血栓性疾病、子宫肌瘤、内膜增生和糖尿病、高血压、肝功能障碍等；且目前仍缺乏其对POI患者死亡率影响的长期前瞻性研究。而干细胞治疗、中医药方法则存在疗效不确切、没有规模性研究数据证实的问题，因此，探索POI更有效的治疗方法具有重要的意义。

网络药理学以系统生物学理论为基础对生物系统进行网络分析，选取特定信号节点开展多靶点药物分子设计、系统阐述机体与药物相互作用的原理和规律。它从“一标一靶”模式向“多靶点、多组分”模式转变的特点与复杂疾病涉及到机体调控网络中多个基因和信号通路的特点相吻合，其系统性和广泛性的视角，在揭示复杂配方的内在机制方面具有优势。网络药理学已经从筛选中药中的有效成分发展到揭示中药组分治疗疾病的相关途径及靶点、剖析方剂配伍规律以探讨更为科学的方剂可能性，在新药研发和现有药物的再利用中具有极大的价值[11]。

金匮肾气丸，最早出自《金匮要略》，有“补肾诸方之祖”之称，由茯苓、附子、桂枝、牡丹皮、山药、山茱萸、熟地黄、泽泻组成，广泛应用于生殖功能减退、弱精子症等生殖系统疾病[12]。金匮肾气丸可通过调节雌二醇(E2)等激素水平改善肾阳亏虚状态[13]，临床上常用于治疗内分泌失调等POI相关症状。受生殖系统和中药本身特点的限制，生殖相关疾病的中药应用发展缓慢，网络药理学的引入，有助于探索潜在的药物新靶点和相关信号通路，进一步了解药物作用机制[11]。目前，有学者通过网络药理学对归肾丸、左归丸等治疗POI的机制进行研究[14-15]，但尚未检索到应用网络药理学探讨金匮肾气丸治疗POI相关机制的研究。因此，本研究运用网络药理学和分子对接技术，通过数据挖掘、网络构建、网络拓扑学结构分析，预测金匮肾气丸治疗POI的作用机制，为进一步寻找治疗POI的新药提供实验依据。

实验筛选后得到金匮肾气丸治疗POI的潜在靶点82个，选取金匮肾气丸药材-活性成分-潜在靶点网络中节点自由度为平均自由度2倍以上的活性成分为核心成分，即治疗POI的核心活性成分包括薯蓣皂苷元、泽泻醇B、羟基芫花素、去氧穿心莲内酯、胡椒碱、槲皮素。选取PPI网络图中R值靠前且网络中节点自由度为平均自由度2倍以上的节点为核心靶点，即ESR1、VEGFA、AKT1为核心靶点。

薯蓣皂苷元是一种植物甾体皂苷元，与雌激素有独特的结构相似性，可促进性激素、皮质激素等甾体类激素的生物合成[16]。羟基芫花素具有抗氧化作用[17]，去氧穿心莲内酯和胡椒碱具有抗炎和氧化应激作用[18-19]。槲皮素能在一定程度上促进各级卵泡发育，增加雌激素分泌，改善卵巢功能[20]；还可以提高卵母细胞和胚胎质量，影响颗粒细胞的增殖和凋亡，降低氧化应激[21]。ESR1主要在卵泡膜上表达，与雌激素结合发挥相应生物学效应。VEGFA是血管内皮生长因子(VEGF)家族中的一员，卵巢滤泡的发育依赖血管生成，尤其是VEGF驱动的血管生长。有研究表明，VEGFA亚型的平衡控制着卵泡的进展和黄体生成，亚型的表达还可以调节哺乳动物的生育能力[22]。AKT1是PI3K-Akt通路的重要蛋白分子，有研究表明AKT过度活化后会导致原始卵泡过度活化和POI[23]。

富集分析结果表明，金匮肾气丸治疗POI的机制可能与PI3K-Akt、MAPK、HIF-1、P53、PPAR、TGF-β等信号通路，正向调整激酶活性、腺体发育、细胞对激素刺激的反应、生殖结构的发育等生物过程相关。其中，PI3K-Akt信号通路作为POI相关信号通路被广泛研究，其下游的信号分子中，叉头转录因子O3(FoxO3a)在卵泡生长的初始阶段能抑制卵泡活化，FoxO3a基因敲除小鼠因整体卵泡激活导致卵母细胞死亡、早期功能性卵泡衰竭和继发性不孕[24]。哺乳动物中雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的活性升高会激活原始卵泡池，从而导致早期卵泡衰竭，引起POI[25]。还有研究表明，AKT激酶可以调节天然免疫细胞(中性粒细胞、巨噬细胞、树突细胞)的发育和功能[26]。MAPK通路可能参与调控卵巢颗粒细胞的细胞周期、增殖和凋亡等过程[27]。HIF-1α的表达量能反应卵巢储备功能，是POI的预测指标之一[28]。P53信号通路的激活可能诱导卵巢组织的凋亡，最终导致POI[29]。PPAR信号通路可能与卵泡发育和调节雌激素分泌有关[30]。TGF-β信号通路能增强FSH刺激的孕酮生成和黄体生成素受体表达，从而促进卵泡存活[31]。正常卵巢功能的维持是一个复杂的过程，上述信号通路在其中均发挥重要作用，然而通路与通路之间的关联、核心的启动因子尚未研究明确。

我们将筛选出的金匮肾气丸中的核心活性成分和POI发病的核心靶点分别进行分子对接，进一步验证两者的结合活性，结果显示，薯蓣皂苷元与ESR1、VEGFA、AKT1，泽泻醇B与ESR1、AKT1，羟基芫花素与ESR1，胡椒碱和ESR1具有较强的结合力。

综上所述，本研究通过网络药理学和分子对接技术预测金匮肾气丸治疗POI的作用机制，结果显示金匮肾气丸中的薯蓣皂苷元、泽泻醇B、羟基芫花素、去氧穿心莲内酯、胡椒碱、槲皮素等核心活性成分可能作用于ESR1、VEGFA、AKT1等核心靶点，通过PI3K-Akt、MAPK、HIF-1等信号通路介导细胞生长、增殖、分化、衰老和凋亡，通过抗炎、抗氧化、调节激素合成与分泌等作用发挥治疗作用。但是本研究目前还处在理论层面的预测阶段，接下来还需进一步的动物实验验证，以期为POI的中药治疗提供更多参考。