内蒙古黄瓜靶斑病菌的鉴定及药剂敏感性测定

杨立辉，陈鹏宇，王有贤，刘宝玉，白庆荣，赵廷昌

（1.吉林农业大学植物保护学院 长春 130118； 2.吉林省蛟河市农业综合行政执法大队 吉林蛟河 132500；3.巴彦淖尔市植保植检站 内蒙古巴彦淖尔 015000； 4.中国农业科学院植物保护研究所 北京 100096）

黄瓜（Cucumis sativusL.）是葫芦科一年生蔓生或攀援草本植物[1]，口感爽脆，具有清火利尿、清热解毒的功效，富含蛋白质等多种营养成分，深受人们喜爱。黄瓜是世界十大蔬菜作物之一，在我国各地均有种植，栽培面积超过全国蔬菜栽培总面积的十分之一，栽培品种也逐渐丰富，具有极高的经济价值[2]。

在黄瓜栽培过程中，病害问题比较突出。常见的叶部病害主要有霜霉病、炭疽病、白粉病、灰霉病、靶斑病、细菌性角斑病等。其中由多主棒孢菌[Corynespora cassiicola（Berk&Kert）Wei]引起的黄瓜靶斑病（Cucumber target spot）又被称为褐斑病、小黄点病等，是一种重要的气传性叶部病害[3]，成为近年来黄瓜生产上的重要病害之一。据统计，该病害的田间发生率一般是10%～25%，防治不力可达70%，甚至绝产，经济损失惨重[4]。发病时被侵染的叶片会出现水浸状小点，后变为小型圆斑，病健交界明显，后期病斑继续扩大，呈黄褐色，边缘为深褐色，扩展受叶脉限制，呈不规则形，病叶易脱落[5]。该病害在发病初期又与黄瓜细菌性角斑病、霜霉病和炭疽病初期症状极其相似，不易辨别，经常导致病害防治过程中不能精准用药，防效不佳。

2021 年4 月，在内蒙古自治区赤峰市宁城县五化镇山头村发现大量的黄瓜叶斑病，病害发生迅速，危害极其严重，重病棚内大部分植株枯死，损失惨重，但具体发病原因尚不明晰。笔者对上述地区发生的黄瓜叶斑病的病原菌进行分离纯化及致病性测定，通过对病原菌形态鉴定及分子生物学鉴定确定了病菌的分类地位，同时测定了代表菌株对26种杀菌剂的敏感性，以便筛选到高效低毒的药剂，为生产中该病害的科学防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病样采集及症状观察

2021 年4 月，对内蒙古自治区赤峰市宁城县五化镇山头村的黄瓜病害标本的发病症状及特征进行拍照记录，蜡叶标本保存于吉林农业大学植物病理实验室。

1.2 试验主要仪器

DHG-9140A 电热恒温鼓风干燥箱（上海申贤恒温设备厂）、GXZ 智能型培养箱（宁波江南仪器厂）、DYY-6C 型电泳仪（北京市六一仪器厂）、SW-CJ-2FD 洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、GI80DWS 高压蒸汽灭菌锅（上海言和）、光学显 微 镜（ZEISS ImagerA.2）、超 景 深 显 微 镜（VHS-600）、移液器（艾本德）、电子天平等。

1.3 病原菌的分离、纯化及致病性测定

2021 年5 月，在吉林农业大学植物病理实验室进行病原菌的分离、纯化及致病性测定。在超净工作台中将不锈钢剪刀用酒精灯外焰灼烧灭菌，剪取黄瓜罹病叶片病健交界处4 mm×4 mm 大小的组织块，在75%乙醇溶液中消毒1 min 后用无菌水漂洗3 次，风干2.5 h，用灭菌的镊子将组织块转移到PDA 平板培养基上，每个培养皿接种4～5 块，置于25 ℃恒温培养箱中培养。待菌落长出后，用灭菌的接种铲挑取菌落边缘菌丝块，菌丝面朝下移入新的PDA 平板培养基上培养，连续转接3 次进行纯化，菌种4 ℃保存备用[6]。

将分离得到的菌株在PDA 培养基上培养，待其长出孢子后，用无菌水配制成浓度为1×106个·mL-1的孢子悬液。采用常规喷雾法，在温室选取健康的黄瓜植株（硕宝，唐山恒丰种业有限公司）喷洒孢子悬浮液，以喷洒无菌水为对照。每个菌株随机选取5 株黄瓜苗接种，试验设置3 次重复，套塑料袋，保湿培养48 h 后撤袋。接种后3、5、7 d 观察发病情况并拍照记录。参照柯赫氏法则，选取发病的叶片再次对其进行组织分离，若分离物与接种菌株形态一致即可确认此分离物为该病害的致病菌[7]。

1.4 病原菌的鉴定

1.4.1 病原菌的形态特征观察 观察病原菌在PDA 培养基上的菌落形态、颜色及生长状况。使用光学显微镜（ZEISS ImagerA.2）观察分生孢子及产孢结构并拍照，超景深显微镜（VHS-600）测量病原菌的100 个分生孢子大小。参照相关文献与所观察结果进行对比分析，初步鉴定病原菌的种类。

1.4.2 病原菌的分子生物学鉴定 采用Biospin 真菌基因组DNA 提取试剂盒（BSC14S1，杭州博日科技股份有限公司）提取病原菌DNA。以总DNA 为模板，利 用 通 用 引 物 ITS1/ITS4（5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’/5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）进行PCR 扩增[8]。25 μL 的PCR 反应体系如下：PremixTaq［RR901Q，宝日医生物技术（北京）有限公司］12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL以及ddH2O 9.5 μL；PCR 扩增程序如下：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，共34 个循环，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

PCR 产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，待出现清晰条带后送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，将所得序列在NCBI 网站（http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）上与GenBank 中相关序列进行同源性比对分析，确定病原菌的分类地位。

1.5 病原菌室内药剂敏感性测定

供试菌株：代表菌株HGBB-Ⅲ由吉林农业大学植物病理实验室分离鉴定并保存。供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g、蒸馏水1000 mL，于115 ℃高压灭菌30 min；水琼脂培养基（WA），琼脂15 g、蒸馏水1000 mL，于115 ℃高压灭菌30 min。供试药剂：化学药剂共26 种，药剂名称、有效成分、剂型及生产厂家信息见表1。

表1 供试药剂

2021 年6－8 月通过菌丝生长速率法测定病原菌菌丝生长对供试药剂的敏感性。将每种药剂用无菌水稀释成1×103、1×102、1×101、1、1×10-1、1×10-2μg·mL-16 个质量浓度，然后按1∶9 的体积比将药液与PDA 培养基混合制成含药平板。每种药剂的各个浓度3 次重复。对照组（CK）用等量的无菌水代替。代表菌株HGBB-Ⅲ在PDA 培养基上培养7 d，用打孔器取6 mm 直径的菌饼放置到混药平板上，在25 ℃培养箱中恒温培养，待CK 长至培养皿的2/3 时，采用十字交叉法对菌落直径进行测量并记录数据。将所得数据通过IBM SPSS Statistics 25 数据处理软件进行分析，计算EC50并建立毒力回归方程，比较不同药剂的敏感性[9]。

抑菌率/%=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/（对照组菌落直径-菌饼原始直径）×100[10]。

孢子萌发法测定病原菌孢子萌发对供试药剂的敏感性：制备病原菌代表菌株HGBB-Ⅲ的孢子悬浮液，调整浓度为1×106个·mL-1。混药平板的制作与菌丝生长速率法相同，但需要将PDA 培养基换成WA 培养基。微量加样器吸取100 μL 孢子悬液，用涂布器均匀的涂在WA 混药平板上，每个浓度3 次重复，放置在25 ℃培养箱中培养，以芽管长度超过孢子最大直径长度的一半、CK 萌发率达到90%以上作为标准。每个重复观察300 个孢子的萌发情况并记录，将所得数据通过SPSS 数据处理软件进行分析，计算EC50并建立毒力回归方程，比较病原菌的孢子萌发对不同药剂的敏感性[11]。

孢子萌发率/%=（萌发孢子总数/孢子总数）×100。

孢子萌发抑制率/%=（对照孢子萌发率-处理孢子萌发率）/对照孢子萌发率×100[10]。

2 结果与分析

2.1 病害症状

由图1 可知，病原菌以危害黄瓜叶片为主，正反面均可被侵染。发病初期为黄色水渍状斑点，后期扩散成圆形或不规则形，叶片正面病斑粗糙不平、病斑整体浅褐色、病健交界处明显、易穿孔，中后期多个病斑连接成片。

图1 黄瓜靶斑病发病症状

2.2 病原菌的分离、纯化与致病性测定

通过组织分离法对罹病叶片进行分离、纯化后获得20 个菌落形态一致的菌株。采用孢子悬浮液喷雾法将所得到的20 个菌株配成孢子悬浮液，喷洒到健康黄瓜叶片上进行致病性测定，3 d 后经过孢子悬浮液处理后的叶片出现黄色点状病斑（代表菌株接种情况见图2），与田间发病初期症状基本相同；喷洒无菌水的对照组叶片无发病症状。将发病叶片重新进行组织分离，所得分离物的培养特征、孢子形态与接种菌株一致，因此可以确定分离得到的20 株菌均为黄瓜靶斑病的致病菌。

图2 代表菌株HGBB-Ⅲ致病性测定结果

2.3 病原菌的鉴定

2.3.1 病原菌形态学特征 病原菌在PDA 培养基上培养7 d 后，菌落近圆形，边缘整齐，菌落中心呈灰绿色，边缘呈白色散射状，致密，有轮纹（图3-A）。分生孢子梗直立或弯曲、多单生、有分隔、无分支（图3-B）。分生孢子呈圆柱形，近倒棍棒状，浅褐色，孢子大小为（17.52～174.20）μm×（2.48～6.63）μm，有油球，具有1 个或多个隔膜（图3-C、D）。经查阅相关文献，对比形态特征发现该病原菌与Corynespora cassiicola的形态极其相似。

图3 病原菌HGBB-Ⅲ的形态特征

2.3.2 病原菌分子生物学鉴定 以获得菌株的基因组DNA 为模板，用真菌通用引物ITS1/ITS4 进行PCR 扩增，测序结果在GenBank 数据库中进行BLAST 同源性比较并提交序列，获得登录号为OM943959。结果显示，所测菌株的ITS 序列与GenBank 中Corynespora cassiicola（Accession No.JQ595296）序列的一致性为100%，进一步确定该致病菌为多主棒孢菌[Corynespora cassiicola（Berk & Curt）Wei]。

2.4 病原菌室内药剂敏感性测定

2.4.1 病原菌菌丝生长对供试药剂的敏感性测定结果 由表2 可知，代表菌株HGBB-Ⅲ对26种药剂的敏感程度不同。病原菌菌丝生长对25%咪鲜胺EC、40%肟菌·咪鲜胺EW、40%苯醚甲环唑SC 和10%苯醚甲环唑WG 的敏感性最高，EC50＜1 mg·L-1；对430 g·L-1戊唑醇SC、50%腐霉利WP、50%福美双WP、50%异菌脲WP、75%肟菌·戊唑醇WG、40%唑醚·戊唑醇SC、32.5%苯甲·嘧菌酯SC、30%肟菌·戊唑醇SC 的敏感性略低，1 mg·L-1＜EC50＜10 mg·L-1；对12%苯甲·氟酰胺SC 等14 种杀菌剂的敏感性较差，EC50＞10 mg·L-1；70%甲基硫菌灵WP 对抑制黄瓜靶斑病多主棒孢菌菌丝生长基本无效。

表2 病原菌HGBB-III 菌丝生长对26 种杀菌剂的敏感性

2.4.2 病原菌孢子萌发对26 种药剂的敏感性 由表3 可知，代表菌株C.cassiicolaHGBB-Ⅲ的孢子萌发对供试药剂的敏感性不同。对50%福美双WP的敏感性最高，EC50为0.039 mg·L-1；对42.4%唑醚·氟酰胺SC、200 g·L-1氟酰羟·苯甲唑SC、40%唑醚·戊唑醇SC、12%苯甲·氟酰胺SC 的敏感性较低，10 mg·L-1＜EC50＜100 mg·L-1；对40%肟菌·咪鲜胺EW 等21 种杀菌剂的敏感性较差，EC50＞100 mg·L-1。

表3 病原菌HGBB-III 孢子萌发对26 种杀菌剂的敏感性

3 讨论与结论

多主棒孢菌[Corynespora cassiicola（Berk&M.A. Curtis）C.T.Wei]是棒孢属内寄主最广、发现最早的种，为模式菌种；最早由我国真菌分类学家魏景超于1950 年定名为多主棒孢菌[12-13]。该病菌主要侵染黄瓜，王爽等[14]和李俊香等[15]发现，海南省三亚市和广西壮族自治区武鸣县的甜瓜也可受到侵染；除此之外还能侵染380 属530 余种植物，如番茄、大豆、橡胶、棉花等[16]。由该病菌侵染所引起的黄瓜靶斑病于1906 年[17]在欧洲首次报道，1960 年[18]在中国首次发现，目前在我国辽宁[19]、山东[20]、宁夏[21]、广东[7]等多个省、自治区均有发生，但并未见内蒙古自治区由多主棒孢菌（C.cassiicola）侵染引起黄瓜靶斑病发生与危害的报道。因此，笔者的研究对防控内蒙古自治区此病害具有重大意义。

笔者发现C.cassiicola菌丝生长对25%咪鲜胺EC 的敏感性最高，EC50为0.028 mg·L-1，与徐丽慧等[22]、迟晓红等[23]的研究结果一致；对40%苯醚甲环唑SC、10%苯醚甲环唑WG 和430 g·L-1戊唑醇SC的敏感性也较高，EC50分别为0.752、0.890 和1.331 mg·L-1；并且代表菌株对75%肟菌·戊唑醇WG 也较为敏感，与2020 年吴仁锋等[24]报道75%肟菌·戊唑醇WG 对黄瓜靶斑病的田间防效可达86.5%相吻合。而张乃楼等[25]曾测定了辽宁省黄瓜靶斑病菌对97.3%苯醚甲环唑和98%戊唑醇原药的敏 感 性，平 均EC50为（7.109±4.578）μg·mL-1和（9.398±4.944）μg·mL-1。笔者的研究中50%福美双WP（天津市施普乐农药技术发展有限公司）对C.cassiicola代表菌株孢子萌发的抑制作用最高，EC50为0.039 mg·L-1，同时对菌丝生长的抑制效果也较好，EC50为1.708 mg·L-1；祁之秋等[26]发现50%福美双WP 对靶斑病菌孢子萌发的抑制作用略为明显，EC50为6.62 μg·mL-1；阚琳娜等[27]发现，50%福美双WP 对黄瓜靶斑病的田间防效可达89.16%。综合上述研究结果，福美双可作为防控黄瓜靶斑病的首选药剂。

福美双在中国农药信息网（http://www.icama.org.cn/hysj/index.jhtml）上登记主要用于防治黄瓜白粉病、霜霉病，也有复配制剂用于防治黄瓜炭疽病和黑星病[28]。笔者的研究结果表明，该药剂不仅可以用于防治上述病害，在黄瓜靶斑病的防治上也具有非常大的优势。近年来，在生产中发现黄瓜靶斑病防治难度加大，很多药剂并不能取得较好的防治效果，病原菌田间抗药性问题也日趋严重，通过病原菌对药剂敏感性的测定，筛选出一些抑菌活性较高的药剂进行混用或者交替使用是防治病害的有效途径，也是延缓病菌抗药性产生的有效措施，对生产中病害的防控具有重要意义。

笔者对来自于内蒙古自治区赤峰市宁城县五化镇山头村的黄瓜病害标本进行组织分离，共获得菌株20 株，经柯赫氏法则验证、形态及分子生物学鉴定，该20 株菌均为致病菌Corynespora cassiicola，所引起的病害为黄瓜靶斑病。选取26 种化学药剂同时采用菌丝生长速率法和孢子萌发法进行室内药剂敏感性测定，结果显示，代表菌株HGBB-Ⅲ孢子萌发对50%福美双WP 最为敏感，可用于黄瓜靶斑病害的预防；菌丝生长对25%咪鲜胺EC、40%肟菌·咪鲜胺EW、40%苯醚甲环唑SC 和10%苯醚甲环唑WG 4 种药剂敏感性较高，病害发生后的治疗过程可用50%福美双WP 与上述4 种药剂进行混配使用，具体防治效果有待于进一步试验验证。