InDel 标记在萝卜杂交种圆都1 号纯度鉴定中的应用

方小雪，张铖锋，吴新胜

（宁波微萌种业有限公司 浙江宁波 305101）

萝卜（Raphanus satirusL.）属十字花科，一年或二年生草本植物，主要以膨大的肉质直根作为产品器官，富含糖、维生素和萝卜硫素等营养物质，具有一定的药用食疗价值[1]。我国萝卜种植区域遍布南北各省，常年种植面积达120 万hm2，总产量约4000 万t，是主要的大宗蔬菜作物之一[2]。萝卜杂交品种兼具抗病性强、商品性好和产量高等优点，有良好的经济效益，是目前我国栽培萝卜的主要类型。圆都1 号萝卜是由宁波微萌种业有限公司在2018 年培育的杂交新品种，具有肉质脆甜爽口、不易糠心和耐抽薹等特点。至2021 年，圆都1 号萝卜种子销售量逐年增长，在浙江、江苏、上海、安徽等地均有种植。萝卜杂交种圆都1 号的进一步推广需要更多优质种子作为保障，同时也需要高效精准的种子检测技术作为支撑。

杂种优势在生物界普遍存在，是指杂合体在一种或多种性状上优于两个亲本的现象[3]。杂种优势利用作为遗传应用的典型代表，已在水稻、玉米和小麦等作物中取得了丰硕成果[4-6]。近年来，萝卜的杂种优势利用逐渐受到重视，已有多个性状优良的萝卜杂交新品种上市。在萝卜杂交制种过程中，常因混入亲本自交种子或其他品种种子等生物学混杂问题而降低种子纯度，进而影响作物的产量和品质。因此，种子纯度鉴定是保证萝卜杂交种质量的必要检测流程，也是萝卜杂交种优质高产的坚实保障。目前，我国萝卜种子纯度鉴定主要以田间表型鉴定为主，该鉴定方法极易受环境因素干扰，存在田间表型特征不易把握和耗时过长等问题[7]。根据种子纯度鉴定的发展方向，结合现有的技术手段，急需建立一种能快速精准鉴定萝卜杂交种种子纯度的方法。

InDel（Insertion/Deletion，InDel）多态性分子标记是基于插入或缺失位点两侧的序列来设计特异性引物并进行PCR 扩增的标记[8]。过去，SSR 分子标记作为主要的分子标记技术，早已在黄瓜、甜瓜和萝卜等作物的纯度鉴定中成功应用[9-11]。但应用SSR 分子标记做纯度鉴定的工作相对繁琐，需要从大量的引物库中筛选，会耗费大量时间和精力。相比SSR 标记，InDel 标记不仅设计引物的工作量明显减少，而且扩增产物的带型清晰简单，稳定性和分离效果更佳[12]。近年来，InDel 标记已成功应用于青梗菜、甘蓝等作物的种子纯度鉴定，检测速度和准确性均得到验证[13-14]。由此可知，应用InDel 标记开展萝卜杂交种的纯度鉴定工作是可行的。

笔者基于萝卜全基因组数据（Raphanus sativus（assembly Rs1.0））对萝卜杂交种圆都1 号亲本（父本：2348M832，母本：V01A107238）进行全基因组重测序，通过对比分析父本与母本的重测序结果，利用二者间的差异性位点设计InDel 标记引物，以此进行圆都1 号萝卜的纯度鉴定。通过与田间表型鉴定结果相互验证，以期开发出具有实用性的InDel 分子标记，为以后开展大规模萝卜杂交种纯度鉴定奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为圆都1 号萝卜种子，由宁波微萌种业有限公司杂交制种后所得；父本2348M832 由福建省福州市闽侯县的地方萝卜品种原白萝卜经5 代自交分离、纯化后所得；母本V01A107238 由浙江省上虞县地方品种湖田萝卜经4 代自交分离、纯化后所得。

1.2 器材与试剂

器材：离心管（规格：2.0 mL、1.5 mL）、钢珠（直径：2 mm）、多组织研磨仪、水浴锅、离心机、移液枪、PCR 板、PCR 仪、电泳仪、电泳槽、BIO-RAD 凝胶成像仪。试剂：CTAB DNA 提取液、NaHSO3、异戊醇、CHCl3、ddH2O、异丙醇、75%乙醇、琼脂粉、电泳液、2×TaqMaster Mix、Maker I。

1.3 方法

1.3.1 田间小区种植 2021 年11 月20 日将圆都1号杂交种播种于宁波微萌种业有限公司邱隘农场设施大棚内，父、母本各种25 株，株距和行距分别为15 cm 和20 cm，栽培面积约60 m2，共计360 株。植株生长期间有2 株缺失，剩余358 株作为试验对象。

1.3.2 田间纯度鉴定方法 田间358 株圆都1 号萝卜植株播种后35 d 开始观察植株田间表型性状，3～5 d 观察1 次，共3 次。

1.3.3 DNA提取 于2022 年1 月10 日，随机选取圆都1 号萝卜及其父、母本植株各10 株，用打孔器在植株新展开功能叶上取样，获得萝卜圆都1号及其父、母本的混合样品，并置于装有钢珠（直径2 mm）的2 mL 离心管内。离心管置于多样品组织研磨仪内，设置60 Hz 并运行90 s 获得样品匀浆。匀浆中加入700 μL 含有NaHSO3（NaHSO3浓 度10.4 g · L-1）的CTAB 溶液，并 以65 ℃水 浴30 min。水浴后，加入700 μL CHCl3和异戊醇混合液（CHCl3与异戊醇的体积比为24∶1）并离心（8000 r·min-1，10 min），提取400 μL 上清液置于1.5 mL 离心管。上清液加入预冷异丙醇（IPA）300 μL 并离心（12 000 r·min-1，10 min），倒出上清液留底，以75%乙醇漂洗后风干，用ddH2O 溶解获得DNA 水溶液，即混合基因池。

于2022 年1 月23 日，从待测的358 株圆都1号萝卜的新叶上取样，以CTAB 法提取DNA，纯度检测后以ddH2O 溶解稀释至100～200 ng·μL-1，存放于-20 ℃冰箱内备用。

1.3.4 全基因组重测序及InDel 位点筛选 父、母本混合基因池送到天津诺禾致源科技股份有限公司进行全基因组重测序，获得原始数据（raw data）。原始数据去除接头序列和数据质控后获得clean data，并通过BWA 软件比对萝卜全基因组数据，对父、母本变异位点进行对比和筛选，其结果用SAMTOOLS 软件去除重复并检测InDel 位点，软件ANNOVAR 对InDel 位点进行基因注释[15]。

1.3.5 引物设计 根据重测序预测到的InDel位点，选取父本缺失、母本无变异的InDel＞40 bp 的位点，利用Primer Premier 5.0 软件在差异位点两侧保守区设计引物。为确保扩增的特异性，引物设计参数特别考虑GC 含量40%～50%，退火温度50～60 ℃，引物片段长度17～25 bp，引物PCR 扩增产物长度200～300 bp。

1.3.6 PCR 体系和电泳 PCR 扩增采用近岸蛋白质科技有限公司的2×TaqMaster Mix。PCR体系为20 μL：DNA 模板1.5 μL（DNA 质量浓度100～200 ng·μL-1），正反向引物各1.5 μL（引物质量浓度10 ng·μL-1），2×TapMaster Mix 10 μL，超纯水5.5 μL。PCR 扩增程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性20 s，51.5 ℃退火20 s，72 ℃延 伸40 s，循 环35 次，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。采用A3-1大型凝胶电泳系统，设置350 V 电压和500 mA 电流，以4%琼脂糖凝胶电泳50 min，最后通过BIO-RAD 凝胶成像系统获取图像。

1.3.7 计算公式 纯度/%=（检测总量-杂株数量）/检测总量×100； （1）

吻合率/%=（室内结果/田间结果）×100。（2）

2 结果与分析

2.1 引物筛选

通过对圆都1 号萝卜亲本进行全基因组重测序，筛选InDel 位点并设计出6 对引物（表1）。6 对引物对圆都1 号萝卜及其父、母本的DNA 样品进行PCR扩增，其琼脂糖凝胶电泳结果如图1 所示。根据电泳结果，引物L-1 父本扩增不出条带被淘汰；引物L-5和L-6 亲本间扩增条带无多态性被淘汰。引物L-2、L-3 和L-4 在父本和母本间的扩增条带都存在特异性，杂交种圆都1 号可扩增出父、母本2 个条带；但引物L-3 父本和母本间的扩增条带差异较小，电泳检测时间长；引物L-2 在杂交种圆都1 号存在非特异性扩增条带，只有引物L-4 带型清晰且电泳检测时间合理。因此，试验最终选定引物L-4 用于萝卜杂交种圆都1 号的纯度鉴定，其父本和母本扩增片段大小分别为254 bp 和297 bp。

表1 6 对萝卜InDel 标记信息

图1 不同引物对圆都1 号萝卜及其父、母亲本DNA 样品的琼脂糖凝胶电泳

2.2 引物L-4检测圆都1号萝卜植株纯度

利用引物L-4 对田间358 株圆都1 号萝卜进行纯度检测，其中编号为26、85、121、257、284 的萝卜植株均只扩增出母本条带，其余353 株萝卜均为F1型双条带，其中编号121～168 与241～288 萝卜植株的琼脂糖凝胶电泳结果如图2 所示。因此，通过纯度鉴定计算，可以获得该批圆都1 号萝卜的纯度为98.60%。

图2 引物L-4 检测圆都1 号萝卜部分植株的琼脂糖凝胶电泳结果

2.3 田间表型鉴定圆都1号萝卜植株纯度

圆都1 号萝卜杂交种植株的田间表型为叶丛半直立、叶色绿、株幅大、裂刻中；萝卜圆都1 号母本植株的田间表型为叶丛半直立、叶色深绿、株幅小、裂刻中；二者的肉质根皮色和肉色均为白色。异花粉杂株无特定的田间表型性状，需要与F1在叶色、株幅和肉质根颜色等表型性状上全面比较。通过对田间358 株萝卜植株的长势、叶色和株幅等性状进行鉴定，有8 株因长势较弱、叶色深绿、株幅小等特点被鉴定为母本或异花粉杂株，获得纯度为97.77%。图3 中，白框内的萝卜相比其他植株叶色更深和株幅更小，因此被鉴定为杂株。

图3 圆都1 号萝卜与亲本杂株田间表型鉴定

2.4 InDel标记检测与田间表型鉴定纯度结果对比

通过引物L-4 分子检测与田间表型鉴定对358株萝卜植株开展纯度检测，纯度结果如表2 所示。引物L-4 分子鉴定有5 株母本或异花粉杂株，纯度为98.60%；田间表型鉴定有8 株杂株，纯度为97.77%。引物L-4 分子鉴定与田间鉴定的结果对比，编号为156、166、229 的3 株植株鉴定结果存在差异，其余350 株圆都1 号杂交种和5 株杂株的检测结果一致，吻合度高达99.16%。

表2 圆都1 号萝卜InDel 标记与田间表型观察鉴定纯度结果对比

2.5 InDel标记与田间表型鉴定结果差异分析

对编号为156、166、229 的3 株植株再通过引物L-4 分子检测，结果如图4 所示，扩增出父本和母本2 条条带。同时，留存编号156、166、229 植株继续生长以待后续继续观察，3 周后其表型开始与F1一致。因此，引物L-4 能够代替田间表型鉴定对圆都1 号萝卜做纯度鉴定。

图4 InDel 标记对田间鉴定母本杂株的验证

3 讨论与结论

种子纯度是杂交种质量的关键指标，直接影响着农作物的产量和品质。纯度鉴定作为保障种子纯度的必要流程，目前主要以田间表型鉴定和分子标记等方式对种子纯度做出鉴定[16]。

在田间表型鉴定过程中，需要在植株不同生长阶段进行多人多次鉴定，从而降低人为主观臆想和环境变化等因素对鉴定结果带来的误差。笔者试验中，编号156、166、229 植株因长势弱、叶色较深被鉴定为母本或异花粉杂株，与分子检测结果不同。在实际萝卜栽培中，无法为每个植株提供相同且适宜的生长环境，局部的土壤肥力缺失或病虫害胁迫均会影响圆都1 号萝卜的正常生长。已有大量的研究结果表明，不适宜的生长环境或胁迫条件下植株的生长会受到抑制，其叶面积大幅减小，叶色加深[17-18]。因此，可能是因局部不利的生长环境造成编号156、166、229 萝卜植株的表型性状与母本相似，从而影响田间表型的鉴定判断。

SSR 分子标记因引物广谱性好、操作简单和成本低等特点，一直是重要的DNA 分子标记技术，已在水稻、油菜、西瓜和棉花等作物的种子纯度鉴定中被广泛应用[19]。随着全基因组测序技术的发展，InDel 标记逐渐被人所熟知，并成功应用于青梗菜、甘蓝等蔬菜作物的纯度鉴定。InDel 标记的多态性相比SSR 标记要低，其带型简单、分布较密，在遗传分析或基因诊断中的重现性、准确性和分辨率大大提高[20]。目前，SSR 分子标记已成功应用于北斗75和七星萝卜品种的杂交种纯度鉴定[21-22]，但应用In-Del 标记开展萝卜杂交种纯度鉴定尚未见相关报道。笔者在圆都1 号萝卜全基因组重测序的基础上，利用父母本间的InDel 位点设计引物，以此利用InDel 分子标记对萝卜杂交种进行纯度鉴定。结果显示，InDel 标记检测与田间表型鉴定结果吻合度高达99.16%，且检测结果直观快速，无人为主观臆想和环境因素的干扰。因此，InDel 标记能够应用于萝卜杂交种圆都1 号的纯度鉴定，并兼具高效性和准确性等优点。

高效准确的InDel 标记纯度检测有助于圆都1号萝卜的快速推广，并显著减少公司在纯度鉴定中所需的时间和精力。在实际应用中，考虑到分子标记纯度鉴定需要高通量快速进行，设计InDel 引物时应综合考量扩增产物的质量、稳定性和分离速度。笔者从引物设计、引物筛选、大规模检测、田间表型鉴定结果比对和再验证等流程出发，对如何应用InDel 标记开展萝卜杂交种圆都1 号鉴定工作进行了系统性阐述，也为今后其他杂交种应用InDel标记提供了借鉴。