葡萄籽原花青素对断奶仔猪背最长肌抗氧化能力与肌纤维类型的影响

金宏莉, 孙 露, 张瀚文, 陈亚楠, 张 昊,王 恬

(南京农业大学 动物科技学院，江苏 南京 210095)

近年来生活水平不断提高、饮食观念逐渐转变，人们对畜产品的要求越来越高。肌纤维是构成肌肉的基本单位，肌肉中肌纤维类型组成显著影响宰后肌肉的颜色、pH、系水力、嫩度、多汁性及风味等肌肉品质性状，因此肌纤维的类型及组成与肌肉品质的优劣密切相关[1]。肌纤维的分类方法很多，目前最为广泛认可、准确性高的肌纤维分类方法即按照肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)亚型的多样性进行分类，成年哺乳动物骨骼肌可表达4种异构体，分别为MyHC Ⅰ(慢速氧化型)、MyHC Ⅱa(快速氧化型)、MyHC Ⅱx(中间型)、MyHC Ⅱb(快速糖酵解型)型[2-4]。在妊娠的前90 d，猪机体肌纤维数目就已稳定，但其肌纤维类型可受出生后年龄、环境、营养、运动、应激及激素等因素影响而发生转变[5]。MyHC亚型转化次序为Ⅰ型↔Ⅱa型↔Ⅱx型↔Ⅱb型。通过改变肌纤维类型来改良肌肉品质已成为现今及未来肌肉品质改良研究的热点。

原花青素(proanthocyanidins)，其化学式为C30H26O13，相对分子质量为594.52，是一种主要存在于葡萄籽、花生衣和高粱皮等植物中的多酚类化合物[6-7]。原花青素分子中含有多个活性较强的酚羟基, 在动物体内被氧化后释放H+，与自由基及氧化物发生竞争性结合，从而保护脂质不被氧化，阻断自由基链式反应，具有很强的氧自由基清除能力和抗氧化活性，故备受关注[7]。目前，原花青素已广泛应用到食品、营养等多个领域[8-9]。王友良等[10]按照50、100和150 mg/kg的剂量给反式脂肪酸(trans fatty acids,TFAs)攻毒小鼠饲喂原花青素，结果发现相比TFAs应激对照组，原花青素缓解组肝脏损伤程度均得到明显改善，说明原花青素对TFAs攻毒小鼠的肝脏损伤具有良好的保护作用。

目前关于原花青素调节猪肌肉发育的报道较少，其潜在作用机制也尚不清楚。因此，本试验通过在日粮中添加GSP，解析GSP对仔猪断奶后早期阶段肌肉抗氧化能力、肌纤维类型及关键基因表达水平的影响，为了解GSP生物学作用及其在仔猪生产中的应用效果提供试验证据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

GSP(纯度95%)购自天津尖峰天然产物研究开发有限公司。

1.2 试验设计

试验选取遗传背景与体重相近、健康状况良好的雄性断奶仔猪72头，21日龄断奶，随后将其随机分为2个处理组，每组6个重复，每重复6头仔猪。试验期间，对照组饲喂基础日粮，试验组饲喂添加500 mg/kg GSP的试验日粮，共计饲喂14 d，每天由专人定时饲喂仔猪，期间自由饮水。基础日粮组分详见表1。

表1 基础日粮配方及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient level of the basal diet (air-dry basis)

1.3 饲养管理

本试验在安佑集团江苏太仓种猪场展开。试验期间，仔猪自由饮水，每日分别于06:00、09:00、11:00、14:00、17:00定时喂饲日粮。免疫程序按常规进行。

1.4 样品采集与处理

试验结束时，每个重复随机选择1头仔猪，将其麻醉后颈动脉放血处死，在胴体第10根肋骨处采集背最长肌样本，大小为 0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，液氮速冻后置于-80 ℃超低温冰箱，用于制备冰冻切片，进行肌纤维类型观察。另外，收集大约2 g背最长肌样本，液氮速冻后保存于-80 ℃超低温冰箱，用于测定背最长肌抗氧化指标和相关基因mRNA表达水平。

1.5 测定指标与方法

1.5.1 肌肉抗氧化指标测定 组织匀浆制备：称取100 mg背最长肌冻存样本，按1∶4倍体积比加入0.86%生理盐水，在冰水浴中用高速匀浆机匀浆至离心管中无明显块状物。匀浆完成后，4 ℃条件下于3 000 g离心15 min，取上清液分装并置于-20 ℃冰箱中保存。采用BCA法测定蛋白浓度，使用南京建成生物工程研究所商业试剂盒，测定背最长肌中总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性以及总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量，严格按照试剂盒说明书进行检测。

1.5.2 肌肉抗氧化关键基因表达 使用Trizol试剂提取断奶仔猪背最长肌总RNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，核酸浓度仪检测RNA浓度和纯度。使用Takara(辽宁，大连)反转录试剂盒获取单链DNA (cDNA)作为实时荧光定量PCR模板。根据GenBank提供的基因序列，使用Primer软件设计目的基因：核转录因子红系2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,NRF2)、血红素氧化酶1(heme oxygenase 1,HO1)、还原型辅酶/醌氧化还原酶1(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate quinone oxidoreductase 1,NQO1)、超氧化物歧化酶1(SOD1)、超氧化物歧化酶2(SOD2)、谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的引物序列，引物信息如表2所示。采用Applied Biosystems(Foster City, CA, USA)StepOnePlusTMReal-Time PCR System进行qRT-PCR反应。qRT-PCR反应体系为10 μL，包括5 μL 2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix、0.2 μL上游引物、0.2 μL下游引物、0.2 μL 50×ROX Reference Dye 1、2.4 μL灭菌超纯水和2 μL cDNA模板。PCR反应条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，40个循环。溶解曲线分析条件按系统推荐设置。GAPDH为内参基因，结果以2-ΔΔCt法进行表示。

1.5.3 肌纤维类型观察 将用于组织化学分析的背最长肌样品先从-80 ℃冰箱转入-30 ℃冰箱，逐步回温然后沿肌纤维垂直方向制作厚度为10 μm的冰冻切片，经过固定、孵育、氯化钴置换、硫化铵显色等步骤后进行镜检。Ⅰ型肌纤维呈浅灰色或无色，Ⅱ型肌纤维呈深灰色或黑色，在显微镜下观察肌纤维，拍照并统计2种肌纤维类型比例。

1.5.4 肌纤维类型关键基因表达 使用Trizol试剂提取断奶仔猪背最长肌总RNA，1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，核酸浓度仪检测RNA的浓度和纯度。使用反转录试剂盒获取cDNA作为实时荧光定量PCR的模板。根据GenBank提供的基因序列，使用Primer软件设计目的基因MyHCⅠ、MyHCIIa、MyHCⅡx、MyHCⅡb、生肌决定因子1(myogenic differentiation 1,MyoD1)和内参基因GAPDH的引物序列，引物信息如表2所示。采用Applied Biosystems公司(Foster City, CA, USA)StepOnePlusTM Real-Time PCR System进行qRT-PCR反应。qRT-PCR反应体系为20 μL，包括10 μL SYBR Premix Ex Tag、0.4 μL上游引物、0.4 μL下游引物、0.4 μL ROX Reference Dye、6.8 μL灭菌超纯水和2 μL cDNA模板。PCR反应条件为：在95 ℃下预变性30 s，在95 ℃下变性5 s，在60 ℃下退火30 s，共40个循环。溶解曲线分析条件按系统推荐设置。GAPDH为内参基因，结果以2-ΔΔCt法进行表示。

表2 实时荧光定量PCR引物序列信息Table 2 Primer sequence information of real-time quantitative PCR

1.6 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 断奶仔猪肌肉抗氧化指标

由表3可知，与对照组相比，试验组仔猪断奶后背最长肌GSH-Px、CAT无显著变化(P>0.05)；与对照组相比，屠宰前饲喂14 d GSP显著提高了仔猪断奶后早期背最长肌中T-AOC、T-SOD活性，显著降低了背最长肌中MDA含量(P<0.05)。

表3 葡萄籽原花青素对断奶仔猪背最长肌抗氧化指标的影响Table 3 Effects of grape seed proanthocyanidins on theantioxidant parameters of longissimus dorsi musclein the weaned piglets

2.2 断奶仔猪肌肉抗氧化关键基因的表达

由表4可知，与对照组相比，试验组仔猪断奶后背最长肌NRF2、NQO1和GPX1基因mRNA表达量均无显著差异(P>0.05)。连续饲喂14 d GSP显著提高了断奶仔猪背最长肌HO1、SOD1和SOD2基因的mRNA表达量(P<0.05)。

表4 葡萄籽原花青素对断奶仔猪背最长肌抗氧化关键基因表达的影响Table 4 Effects of grape seed proanthocyanidins on theexpression of key antioxidant genes in the longissimus dorsimuscle of weaned piglets

2.3 断奶仔猪肌纤维类型组织学观察结果

仔猪断奶后背最长肌三磷酸腺苷酶(adenosine triphosphatase,ATPase)酶染色结果见图1。由表5可知，屠宰前饲喂14 d GSP素显著提高了断奶仔猪背最长肌Ⅰ型肌纤维比例(P<0.05)，显著降低了Ⅱ型肌纤维比例(P<0.05)。

图1 仔猪断奶后早期背最长肌ATP酶染色图(100×)Fig. 1 ATPase staining analysis for the longissimusdorsi of weaned piglets (100×)

表5 葡萄籽原花青素对断奶仔猪背最长肌肌纤维比例的影响Table 5 Effects of grape seed proanthocyanidins on the musclefiber types of longissimus dorsi muscle in the weaned piglets %

2.4 断奶仔猪背最长肌肌纤维类型及相关基因的表达

由表6可知，与对照组相比，试验组仔猪断奶后背最长肌MyHCⅡa、MyHCⅡb和MyHCⅡx基因的mRNA表达量均无显著差异(P>0.05)，屠宰前饲喂14 d GSP显著提高了背最长肌中MyHCⅠ基因和MyOD1基因的mRNA表达量(P<0.05)。

表6 葡萄籽原花青素对断奶仔猪背最长肌肌纤维类型和肌肉生长相关基因表达的影响Table 6 Effects of grape seed proanthocyanidins on theexpression of genes related to muscle fiber types and growthin the longissimus dorsi muscle of weaned piglets

3 讨 论

在生猪生产中，受营养、环境及心理等因素影响，仔猪在断奶后早期易发生氧化应激，引发抗氧化能力下降、免疫力降低、肠道功能受损、腹泻率和死亡率升高等一系列负面问题[11]。因此，在断奶仔猪日粮中添加适宜的抗氧化剂能有效减轻机体氧化应激风险，改善仔猪健康状况。在敌草快诱导的急性氧化应激模型中发现，原花青素能够提高仔猪肝脏抗氧化能力，缓解其在应激状态下生长受阻的现象[12]。然而，本试验通过对生长性能的统计发现，日粮添加GSP并未明显影响仔猪在断奶后2周内的日增重、采食量或饲料效率(未发表数据)，这与前人研究结果并不一致，其原因可能与原花青素的种类和添加量、受试仔猪的生长阶段及氧化应激的剧烈程度等因素有关。

本试验发现，日粮添加500 mg/kg GSP显著提高了断奶仔猪背最长肌T-AOC和T-SOD活性，表明GSP可有效提高仔猪肌肉抗氧化能力。T-AOC可反映组织抗氧化物质和抗氧化酶等构成的总抗氧化水平。SOD是抗氧化防御系统的重要成员之一，负责将毒性较强的超氧阴离子转化为毒性较弱的过氧化氢，后者可被GSH-Px或CAT转化为无毒的水分子[13]。与此相似，在大鼠上的研究发现，口服原花青素后大鼠肝脏组织SOD活性明显增强，这或与原花青素激活机体抗氧化防御体系的作用有关[14]。添加适宜剂量的原花青素也可有效提高美洲鳗鲡肝脏SOD活性，提高肝脏抵抗氧化损伤的调节能力[15]。另外，本试验结果表明，连续饲喂14 d含有GSP的试验日粮可有效降低断奶仔猪背最长肌MDA含量。MDA是脂质过氧化反应的主要产物，其含量与氧化应激程度呈正相关性[16-17]。因此，上述结果表明GSP可有效提高断奶仔猪肌肉抗氧化能力，改善肌肉脂质过氧化程度。

NRF2是细胞抗氧化防御体系的关键调节因子，在抵抗氧化应激及修复组织损伤等方面发挥着重要作用[18]。研究发现，GSP能够通过激活NRF2通路以促进NQO1、HO1及SOD2等下游抗氧化基因的转录表达[19]。本试验结果显示，饲喂GSP的试验组背最长肌HO1、SOD1和SOD2 mRNA表达丰度较对照组均显著提高，与前人研究结果基本一致。HO1在各组织器官均有表达，可通过催化血红素降解，产生具有细胞保护作用的活性物质，具有抗氧化、免疫调节及抗凋亡等作用[20-21]。SOD1和SOD2分别编码位于细胞质的铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-superoxide dismutase，Cu/Zn-SOD)和位于线粒体内的锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，Mn-SOD)，其表达上调也一定程度地解释了GSP试验组肌肉T-SOD活性升高的现象。另外，苏凡等[22]在缺血再灌注损伤模型中发现，GSP干预可上调HO1表达，促进抗氧化反应和损伤修复。孙明等[23]也发现GSP处理能够提高细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)蛋白磷酸化水平，进而上调了NRF2和HO1蛋白表达水平。上述结果表明，GSP可通过激活NRF2介导的抗氧化防御机制，以改善断奶仔猪背最长肌抵抗氧化应激的能力。

肌纤维是骨骼肌的基本结构单位，其组成及类型是影响宰后肌肉品质的重要因素。有研究表明，肉的嫩度、色泽与Ⅰ型和Ⅱa型肌纤维含量呈正相关，而与Ⅱb型肌纤维含量呈负相关。因此，Ⅱb型肌纤维数量越多，肉品质越差[24]。本试验中，肌纤维染色结果表明，连续饲喂14 d含有GSP的试验日粮显著提高了仔猪断奶后早期背最长肌Ⅰ型肌纤维比例，降低了Ⅱ型肌纤维比例，说明GSP可能起到改变肌纤维组成的作用。通常，不同类型肌纤维的数量均与其相应的MyHC编码基因表达水平呈正相关性[25]。本试验结果表明，试验组仔猪背最长肌MyHCⅡa、MyHCⅡb和MyHCⅡxmRNA表达水平与对照组均无显著差异，但MyHCⅠ mRNA表达量显著提高，这与染色结果基本一致。另外，本试验结果表明，试验组背最长肌MyOD1 mRNA表达量较对照组显著提高。MyOD1又称生肌决定因子，可将多种其他类型的细胞转化为成肌细胞，并促进其分化为成熟的肌纤维，是控制骨骼肌生长的关键调节因子之一[26]。因此，上述结果提示，在断奶仔猪日粮中添加500 mg/kg GSP具有改善肌纤维类型与促进肌肉生长的潜力。

4 结 论

综合以上结果可知，日粮添加500 mg/kg水平的GSP具有改善断奶仔猪背最长肌抗氧化能力与提高Ⅰ型肌纤维比例的积极作用。