探讨皖北地区孕妇人群中p.Arg435His-IgG3同种异型的阳性率

许珣，吴静，朱翔，管政

IgG抗体是唯一可以通过胎盘屏障导致胎儿和新生儿溶血病(hemolytic disease of the fetus and newborn,HDFN)的一类抗体。IgG抗体亚类中，IgG3与其他亚类相比表现出最强的免疫学效应[1]，但IgG3半衰期较短，仅为7天，且胎盘转运不良，故其在HDFN发生及严重程度中作用较小[2]。但有研究[3]发现存在一种IgG3同种异型p.Arg435His-IgG3，其半衰期延长到21天，与其他亚类相当，故这种同种异型p.Arg435His-IgG3在HDFN发生发展中可能比其他亚类抗体更具临床意义。有报道[4]称，p.Arg435His-IgG3在欧洲较为罕见(荷兰为0.9%，芬兰为0.4%)，但在亚洲族群中较为普遍(日本为28%)。目前，国内少有关于p.Arg435His-IgG3的相关报道，为了阐明我国皖北地区p.Arg435His-IgG3同种异型的阳性率，我们对随机抽取的皖北地区孕妇血样进行PCR扩增测序。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 一般资料 随机抽取2019年10月—2021年3月我院住院的177例产科患者血型或抗体效价的血液样本，所有样本均为3 d内的EDTA抗凝血样本，本研究获得患者知情同意及我院医学伦理委员会审批。

1.2 试剂与仪器 PCR仪(Verity 96well，美国ABI)、凝胶成像仪(FR-980A，上海复日科技有限公司)、测序仪(3730XL，美国ABI)、冷冻离心机(HC-2518R，安徽中科中佳科学仪器有限公司)、台式高速离心机(TD5A-WS，湖南湘仪实验仪器开发有限公司)、电泳仪(DYY-6C，北京六一仪器厂)、电泳槽(DYCP-32B，北京六一仪器厂)、UV-Vis Spectrophotometer(SMA4000，Merinton)、微型旋涡混合仪(WH-3，上海沪西分析仪器厂有限公司)、数显恒温水浴锅(HS-800D，太仓市科教器材厂)；DNA Marker(SM0331)购自于ThermoFisher公司，Ezup柱式血液基因组DNA抽提试剂盒、Taq Plus DNA聚合酶、10X PCR Buffer(含Mg2+)、dNTP、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、DNA Marker(B500347)均购自上海生工生物工程股份有限公司；PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 实验步骤

1.3.1 DNA提取 取200μlEDTA抗凝血，严格参照Ezup柱式血液基因组DNA抽提试剂盒说明书执行DNA的提取。提取后取5 μl DNA溶液1%琼脂糖、1X TAE缓冲溶液电泳(电压120～180 V)检测，单一条带说明DNA完整无降解，有明显的条带说明浓度可以满足PCR要求；采用分光光度计检测浓度和纯度，OD 260/280在1.7～2.0，说明DNA质量较好，小于1.7有蛋白污染，大于2.0有RNA污染。

1.3.2 PCR扩增 PCR体系为25μl,包含基因组模板DNA1μl、引物F和引物R各1μl、Taq酶0.2μl、10XTaq Buffer(with MgCl2)2.5μl、dNTP1μl；循环反应温度为95°C，5 min；94°C，30 S；63°C(每循环降0.5℃)，30 S；72°C，30 S；30个循环后72℃，10min结束扩增。取PCR扩增后产物5 μl 1%琼脂糖凝胶电泳，电泳参数：150 V，100 mA，10～20 min，检测PCR产物大小。采用Primer Premier 5软件设计引物，序列如下：正向引物F 5’-ACCCAAGGATACCCTTATGATT-3’,反向引物R 5’-GAGGCTCTTCTGCGTGAAGC-3’，用于扩增IgG3重链恒定区CH2和CH3的基因片段，预期扩增产物大小为683bp。

1.3.3 测序 目的PCR扩增产物条带切胶纯化回收，方法见SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒，再采用Sanger测序法进行测序，以AJ390235(IMGT基因库登录号)为参考序列，使用MegAlign软件进行测序结果比对分析，并以384位氨基酸密码子突变作为实验结果比对分析内参突变点。

2 结果

2.1 DNA提取及质检 1～10号检测通道分别对应编号为1～10号样本,8～9号通道未有明显条带出现，经检测其浓度无法满足后续的PCR扩增，为3例无效样本，其余样本均质检合格，M通道为DNA Marker:Thermo(SM0331)。见图1。

图1 DNA提取检测图注：1～10号分别对应1～10号样品；M：Marker Thermo (SM0331)

2.2 PCR扩增产物 抽样检测4个样本PCR扩增产物大小，1～4号检测通道分别对应编号22、71、105、126的样本，在600～700 bp,接近700 bp处出现一条明亮的条带，与预期目的基因片段大小(683 bp)基本相符，M通道为DNA Marker: 生工(B500347)。见图2。

图2 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图注：1～4号通道分别对应随机抽取的22、71、105、126号样品,M:Marker生工(B500347)

2.3 基因测序

2.3.1 测序结果比对 以IGHG1(IMGT基因库登录号J00228)、IGHG2(IMGT基因库登录号J00230)、IGHG3(IMGT基因库登录号AJ390235)、IGHG4(IMGT基因库登录号K01316)为参考序列，通过MegAlign 软件进行比对，结果显示扩增出的683bp的目标片段符合IgG3序列特征，且仅有编号19的样本在435位发生氨基酸密码子的突变(g.1053927G>A)，阳性率约为0.57%。比对结果见图3。

图3 MegAlign 软件序列比对图注：IGHG1.seq、IGHG2.seq、IGHG3.seq、IGHG4.seq为参考序列，SC845-1-6.17,SC845-2-6.17,SC845-19-6.17分别代表编号为1,2,19号的样本

2.3.2 实验内参突变点 384位氨基酸密码子测序结果显示,174例样本中纯合子AGC 30例、AAT 61例，杂合子AG/AC/T 83例。见图4。

图4 实验内参点384位氨基酸密码子测序图注：图4A、4B为纯合子，图4C、4D为杂合子

3 讨论

HDFN是由于母婴不合的IgG类血型抗体通过胎盘屏障进入胎儿和新生儿体内所引起的同种被动 免疫反应[5]。IgG是唯一可以通过胎盘屏障的抗体，所以产前检测母体内IgG抗体效价是目前临床预测HDFN发生及严重程度的一项重要指标，但有研究[6-9]发现IgG抗体效价的高低与HDFN的发生及严重程度并非完全正相关，所以有学者[10-14]将研究方向转移到IgG抗体亚类上来。IgG可以分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4这四种亚类,其中IgG3在诱导抗体依赖性细胞毒试验(ADCC)、吞噬和补体激活方面均优于其他亚类[1,3]。然而，金姣等[15]证实孕妇血清中抗A(B)IgG1水平过高是引起ABO血型不合的主要原因；侯玉涛等[16]通过对Rh阴性母亲和新生儿血清中IgG及其亚型的相关性研究也进一步证实了胎儿红细胞上IgG1是引起Rh血型系统相关HDFN的主要亚类。由此可见，尽管IgG3可以介导最强的免疫效应，但IgG1却更具有临床意义。其主要原因是二者半衰期的不同，而导致这种半衰期不同的原因是二者在435位存在单一氨基酸的差异，IgG3在此位置一般为精氨酸(Arg)，而IgG1为组氨酸(His)[4,17]。

新生儿Fc受体(FcRn)是IgG抗体的特异性受体[18-19]，它广泛表达在人胎盘屏障中合胞体滋养层上皮细胞内部的酸性囊泡上，通过酸碱依赖的方式与IgG相结合。在酸性囊泡内，IgG1-Fc段CH2-CH3铰链区中的His435残基发生质子化，易与FcRn的酸性氨基酸残基(Glu115和Asp130)相结合，当结合体运动到胎盘滋养层基底侧时，FcRn与IgG1的亲和力又因为His435的去质子化而大幅度降低，从而释放IgG1抗体到胎儿血循环中，FcRn再返回母体，转运更多的IgG1给胎儿[20]。所以，His435在介导FcRn-IgG1结合过程中起关键作用，从而使IgG1拥有较长半衰期[21]。而IgG3在435位为Arg，Arg与His不同，在中性pH下并不去质子，IgG3与FcRn结合的pH依赖性降低，最终被溶酶体降解，导致它在FcRn介导的运输和循环中失去竞争，从而影响IgG3的回收，继而导致其半衰期极大地缩减，在胎盘中转运效率降低，继而影响IgG3在胎儿或新生儿体内的免疫效应作用。

目前研究[4，21]发现在人群中天然存在三种p.Arg435His-IgG3同种异型变异体V1、V2、V3，其435位氨基酸均为组氨酸，WHO血清学分型法将V1命名为G3m(15)、V2和V3命名为G3m(16)，三者半衰期与其他IgG亚类相当，目前已证实这些IgG3同种异型具有重要的临床意义。Celia等[22]对来自非洲西部贝宁疟疾流行地区的个体研究表明，来自母体的抗疟疾p.Arg435His-IgG3抗体从母体转移到胎儿，对胎儿的保护作用明显优于IgG1或IgG3，降低了胎儿患疟疾的风险。基于上述事实，并结合前述的p.Arg435His-IgG3具有与IgG1相当的半衰期，我们有理由推测p.Arg435His-IgG3血型抗体在HDFN的发生发展中可能具有同样重要的临床意义。

本研究仅发现一例IgG3在435位存在氨基酸密码子的突变，阳性率为0.57%，这与已有的报道[4]存在差异。Helga等[4]研究发现，在中国广州地区G3m(16)阳性率为7.6%(132人中有10人)。究其原因，除了实验方法和样本量不同外，最大可能的原因就是地域差异本身造成的。

从方法学来讲，目前已有的研究[18]使用经典血凝抑制实验，通过血清学分型来确定同种异型。我们知道IGHG基因具有高度同源性，当G3m(16)抗体作为具有免疫原性的抗原与其他IgG3同种异型可能存在交叉抗原或者共同抗原，从而使检测结果出现假阳性；另外也可能已知的检测试剂抗G3m(16)多克隆抗体的特异性不高，导致出现假阳性结果。本研究考虑到多克隆抗体试剂的稀缺性及IGHG基因高度同源性[2,22]，我们设计一对特异性引物以获得IgG3亚类特异性DNA扩增后再测序，直接从基因层面来检测IgG3抗体435位是否存在氨基酸密码子的突变，排除了这种假阳性的可能性。Helga等[4]采用仅识别由292W (G3m(16)292位氨基酸为色氨酸W，G3m(15)292位为精氨酸R)编码的抗原表位的1.5A10抗体来检测G3m(16)，而本实验可检测所有在435位发生氨基酸非同义替换的IgG3同种异型，范围包括G3m(15)和G3m(16)，所以从理论上分析本实验结果应高于已有的检测结果。本实验在设计初将384位氨基酸密码子的突变作为试验内参突变点，测序结果显示384位氨基酸密码子存在突变，174例样本中纯合子AGC 30例、AAT 61例，杂合子AG/AC/T 83例，突变情况与文献报道相符[2]，证实了本实验方法的可靠性。

此外，由于本实验采样人群较少，采样量也较少，可能并不能准确反映皖北地区孕妇人群中p.Arg435His-IgG3的阳性率。

总之，本研究首次对皖北地区孕妇人群中p.Arg435His-IgG3进行检测，仅发现一例IgG3在435位氨基酸密码子的突变，与已有相关性报道[4,22]存在差异，造成这种差异的原因可能是地域和方法学的不同以及小样本量，后续我们将改进实验方法，并加大不同地区采样量，以获得我国孕妇人群中p.Arg435His-IgG3同种异型的更全面更精确的数据，为进一步研究p.Arg435His-IgG3同种异型与HDFN的发生及严重程度提供理论依据。