基于高效液相色谱-质谱联用技术检测畜肉中的瓜尔胶

郭 超，陈 超，李慧晨，王 真，徐若琳，赵文涛，李莹莹，郭文萍,2,*，张朝晖

（1.中国肉类食品综合研究中心，北京 100068；2.肉类加工技术北京市重点实验室，北京 100068；3.中国海关科学技术研究中心，北京 100026）

“注水肉”是指在生猪、牛、羊屠宰前或屠宰过程中，通过灌胃或向血管泵注等形式，将水掺入动物体内得到的生、鲜肉品[1]。注水肉是存在已久的行业乱象，目前“注水肉”不断升级，“注胶肉”开始增多，注入“胶水”的肉品比“注水肉”更加难以识别，各种食用胶因具有强大的增稠性、保水性，被不法分子利用，各类媒体已多有报道[2-3]。胶水的成本低廉，制备“注胶肉”属于欺诈行为，灌注的胶水中往往掺杂有防腐剂，可引入致病微生物、外来物质污染、重金属超标等风险，危害食品安全[2]。

常见的食用胶有卡拉胶、黄原胶、瓜尔胶等[4-5]。其中瓜尔胶是一种具有较强增稠效果的亲水性胶体，是由甘露糖通过β-1,4糖苷键连接而成的主链和α-1,6糖苷键连接的半乳糖侧链构成的半乳糖甘露聚糖，甘露糖与半乳糖物质的量比约为2∶1，分子质量2×106Da左右，自然或者微生物降解分子质量仍可达8×105Da[6-12]。其结构式如图1所示。β-甘露聚糖酶是一类能够酶解含有β-1,4-D-甘露糖苷键的甘露多糖的水解内切酶。经过β-甘露聚糖酶酶解后的瓜尔胶，只被切断主链甘露糖的β-1,4糖苷键，而对通过α-1,6糖苷键相连的支链半乳糖没有酶解作用，从而形成2～10 个单糖单元通过糖苷键连接的半乳甘露低聚糖[13-16]。

图1 瓜尔胶的结构式Fig. 1 Structure of guar gum

GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》中将瓜尔胶列为“可在各类食品中按生产需要适量使用的食品添加剂”，仅在稀奶油及较大婴儿和幼儿配方食品中有限量[17]，因此瓜尔胶应用十分广泛，被应用于各类食品中，包括鸡血豆腐、牛肉糜制品、香肠等[18-21]，但生鲜肉不允许使用添加剂，近年来劣质肉类食材的不断出现，“注水肉”、“注胶肉”等屡有报道，让消费者防不胜防。

目前“注胶肉”尚无相关检测标准或规范，仅可通过相关水分含量标准判断。GB 18394—2020《畜禽肉水分限量》中规定的猪肉的水分质量分数不得高于76%[22]，由于识别的有效性欠缺，对违法样品打击力度不足[23-24]。目前国内外研究中采用最多检测“注胶肉”的技术是低场核磁共振、近红外、分子生物学等方法[25-31]。前2种方法均依赖于主成分分析、判别模型等化学计量学手段，不易推广，而分子生物学方法基质干扰较为复杂，因此上述方法的使用难度较大，并且无法进行准确的定量，难以作为执法检验的依据，限制了其应用。

瓜尔胶分子质量大，因此常规手段难以检测，有部分学者研究将瓜尔胶通过酸解或酶解等方式降解后再进行检测，如离子色谱法[32-33]、液相色谱-串联质谱法[34]。其中离子色谱法将瓜尔胶水解后测定单糖，但未能建立测定畜肉中瓜尔胶的定量方法。而将胶体经过水解后，利用液相色谱-串联质谱仪对特定分子质量的小分子进行质谱检测的方法更具有普适性，并且能够避免假阳性判别的出现，但对于动物源性食品尤其是畜肉中水溶性胶体的液相色谱-质谱法检测研究在国内外文献中鲜见报道。因此本方法将胶体经过酶解后，利用液相色谱-串联质谱仪对特定分子质量的小分子进行质谱检测。针对新鲜肉品中瓜尔胶主要来源为人为添加，该方法可作为打击“注胶”畜肉的有效技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲酸、乙腈（均为色谱纯） 德国CNW公司；磷酸氢二钠、一水合柠檬酸（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；β-甘露聚糖酶（CAS：37288-54-3，纯度≥98%，10 000 U/g）、瓜尔胶（纯度99%） 上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

1290II-6470高效液相色谱-串联质谱仪 美国Agilent公司；HM100刀式研磨仪 北京格瑞德曼仪器设备有限公司；Milli-Q Reference c超纯水机 美国Millipore公司；EFAA-HM-01多管旋涡混合仪 上海安谱实验科技股份有限公司；LYNX 4000型高速冷冻离心机美国Thermo公司；3K15型高速冷冻离心机 德国Sigma公司；HILIC Plus色谱柱（4.6 mm×100 mm，3.5 μm）、HLB固相萃取柱（200 mg/6 mL） 美国Waters公司；C18固相萃取柱（200 mg/6 mL)、中性氧化铝柱（500 mg/6 mL，200～300 目）、滤膜（PTFE，0.22 μm） 上海安谱实验科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

缓冲溶液（pH 3.6）：磷酸氢二钠溶液（0.2 mol/L）：称取14.20 g Na2HPO4于烧杯中，用水溶解并转移至500 mL容量瓶，定容；柠檬酸溶液（0.1 mol/L）：称取21.01 g一水合柠檬酸于烧杯中，用水溶解并转移至1 000 mL容量瓶，定容。量取678 mL 0.1 mol/L柠檬酸溶液于烧杯中，加入约322 mL磷酸氢二钠溶液调节pH值至3.6，混匀。

β-甘露聚糖酶溶液（0.2 mg/mL）：称取0.01 gβ-甘露聚糖酶于具塞试管中，加入50 mL缓冲溶液，混匀。临用现配。

0.1%甲酸溶液：移取甲酸1 mL至1 000 mL容量瓶中，用水定容，混匀。

1.3.2 样品制备

称取试样2 g于50 mL离心管中，依次加入9 mL缓冲溶液（pH 3.6）和0.5 mLβ-甘露聚糖酶溶液（0.2 mg/mL），加盖后涡旋10 min，放入（55±5）℃水浴振荡器中酶解过夜（至少7 h），4 ℃、12 000 r/min离心5 min，将上清液转移至玻璃试管中，沸水浴中加热10 min，冷却后转移至比色管中，用水定容至10 mL，摇匀后取1 mL于离心管中，加入1 mL乙腈混合摇匀，4 ℃、4 500 r/min离心2 min，取上清液待净化。

取1 mL待净化液，通过中性氧化铝柱（无需活化），用刻度管接收流出液，再用2 mL水洗脱，合并接收液。将接收液用乙腈补至4 mL，混匀后过0.22 μm滤膜，供测定。

1.3.3 标准曲线的配制

标准基质（2 g/kg）：准确称取瓜尔胶0.2 g（精确至0.000 1 g），置于200 mL烧杯中，加入10 g水，迅速搅拌均匀，然后边搅拌边加入空白试样，补足至100 g，再次均质，配制成2 g/kg的标准基质，临用现制。

分别称取标准基质：0、0.03、0.1、0.2、0.4、0.8、2 g（精确至0.000 1 g）于50 mL离心管中，不足2 g的，用空白试样补足至2 g（精确至0.01 g），与样品同时进行酶解净化，即上机质量浓度为0、0.75、2.5、5、10、20、50 μg/mL。计算质量浓度时，以标准基质的实际称量值计算。

1.3.4 仪器条件

液相色谱条件：HILIC Plus色谱柱（4.6 mm×100 mm，3.5 μm）；柱温30 ℃；流速0.4 mL/min；进样量5 μL；流动相A为0.1%甲酸溶液，B为乙腈；梯度洗脱程序：0.0 min，5% A，95% B；1.0～4.5 min，60% A，40% B；4.6～6.0 min，5% A，95% B。

质谱条件：电喷雾离子源；采用多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式正扫描；电离电压3 kV；辅助气温度300 ℃；鞘气温度300 ℃；干燥气流量9 L/min；其他参数见表1。

表1 MRM的优化条件Table 1 Optimal MRM MS parameters

2 结果与分析

2.1 高效液相色谱-串联质谱方法建立

如图2所示，质谱峰分别为m/z365.105 16、527.158 45、689.211 36、851.264 83、1 013.317 93、1 175.370 85，共6 个主要峰。在半乳甘露低聚糖分子中，每个结构单元是1 个单糖（甘露糖或半乳糖）残基，其质量数是162，因此，质谱峰m/z=18+162×n+23，其中n表示单糖数目、23是与低聚糖结合的钠离子。各峰之间相差162，与已知单元是一个单糖（甘露糖或半乳糖）残基相符合[16]。

图2 瓜尔胶酶解产物的高分辨质谱图Fig. 2 High-resolution mass spectra of enzymatic hydrolysate of guar gum

因酶解物三糖响应较强，且为瓜尔胶的最小结构单元，因此选用527.1（酶解物三糖）用于质谱MRM检测，其分子式为推断其结构如图3所示[35]，推断其可能的断键机理如图4所示。

图3 用于质谱MRM检测的酶解物三糖的结构信息Fig. 3 Structural information of the trisaccharide in the enzymatic hydrolysate used for mass spectral analysis

半乳甘露低聚糖亲水性强，在ZORBAX Eclipseplus C18、Kinetex F5、ZORBAX SB等色谱柱中保留较弱，不能得到良好的峰形。使用HILIC亲水柱对其进行色谱分离，比较乙腈+水、乙腈+甲酸（0.1%）、甲醇+水、甲醇+甲酸（0.1%）4种流动相体系对酶解物三糖的分离效果，乙腈+甲酸（0.1%）作为流动相可以得到较好分离度及峰形，对瓜尔胶酶解产物的洗脱程序进行优化）。0～3 min设置为流向废液部分，这一设定降低了复杂基质的影响，4～4.5 min为酶解物三糖的出峰区间，4.6～6.0 min流动相回到初始比例，并为下一次进样做准备。

图4 断键机理推断示意图Fig. 4 Schematic diagram of the mechanism of bond breakage

在猪肉基质中，使用外加标方法加入瓜尔胶，经提取净化后上机检测，如图5所示，酶解物三糖在肉类基质中得到有效分离且响应值满足实验要求。

图5 猪肉的酶解物（a）和添加1 g/kg瓜尔胶的猪肉酶解物（b）三糖MRMFig. 5 MRM Mass spectra of enzymatic hydrolysate of pork without (a) and with 1 g/kg guar gum (b)

2.2 前处理方法

2.2.1 水解方式的选择

瓜尔胶的水解方式有酶解、酸解、热解、微波、辐照与超声等多种方式[36-38]。酶解、酸解的应用最为广泛，酸解瓜尔胶往往使用浓度大、酸性较强的酸，如盐酸、硫酸等，酸解后的瓜尔胶直接进入高效液相色谱-串联质谱检测，对色谱柱、质谱损伤较大；而酶解条件较为温和，一般采用弱酸-盐的缓冲体系，且酶解可以选用具有选择性的酶，如β-甘露聚糖酶可以酶切β-1,4-D-甘露糖苷键，α-半乳糖酶可以酶切α-1,6糖苷键。

2.2.2 缓冲溶液pH值

酶解过程主要受酶解溶液的pH值、酶浓度、酶解温度、酶解时间4 个因素影响。以含有0.3%瓜尔胶的猪肉、羊肉、牛肉为底物，磷酸氢二钠-柠檬酸为缓冲体系，在不同pH值条件进行酶解实验，探索最佳酶解条件。虽然体系选用弱酸-盐缓冲体系，但酶解过程中还存在酸水解的情况，因此实验中同时考察了酸水解的程度，结果如图6所示，在pH 2.6～6.0范围内，酸水解程度相近，在pH 6.6～8.0范围，酸水解程度下降。在pH 2.6～4.0范围内，酶水解程度最佳，pH 4.6～6.0范围酶水解程度大幅度下降，在pH 6.6～8.0范围，β-甘露聚糖酶失去活性，酶水解效率低于酸水解效率。因此，采用pH值为3.6的缓冲溶液。

图6 缓冲溶液pH值对瓜尔胶水解的影响Fig. 6 Effect of buffer solution pH on the hydrolysis of guar gum

2.2.3 酶解时间

图7 酶解时间对瓜尔胶水解的影响Fig. 7 Effect of hydrolysis time on the hydrolysis of guar gum

分别以含有0.3%瓜尔胶的猪肉、羊肉、牛肉为底物，考察酶解时间10 min至20 h的酶解效率，以探索最佳酶解条件。如图7所示，在7 h前，瓜尔胶酶解速率较快，含有0.3%瓜尔胶的猪肉、羊肉、牛肉分别在6～7 h能够达到酶解平衡，因此酶解时间选用不低于7 h。

2.2.4 加酶量

使用的β-甘露聚糖酶纯度不小于98%，酶活力10 000 U/g。以含有0.3%瓜尔胶的猪肉、羊肉、牛肉为底物，考察加酶量对瓜尔胶酶解的影响，如图8所示，在加酶量为30 μg时酶解过程即达到平衡，在后续实验中，保证酶过量，选用加酶量为100 μg进行酶解。

图8 加酶量对瓜尔胶水解的影响Fig. 8 Effect of enzyme dosage on the hydrolysis of guar gum

2.2.5 酶解温度

以含有0.3%瓜尔胶的猪肉、羊肉、牛肉为底物，考察酶解温度为40～80 ℃范围的瓜尔胶酶解效率，如图9所示，在较低温度时，酶解效率较低，酶解物三糖响应较低；在50～60 ℃范围，酶解效率较高，酶解物三糖响应较高且较为稳定；在65～80 ℃范围，β-甘露聚糖酶的酶活力受到影响，酶解效率较低。因此，选用（55±5）℃为酶解温度。

图9 酶解温度对瓜尔胶水解的影响Fig. 9 Effect of temperature on the hydrolysis of guar gum

2.2.6 净化方式的选择

样品在提取过程中虽会去除大部分的脂肪、蛋白等干扰物质，但提取溶液中仍含有大量的杂质，会在后续的检测过程中产生明显的基质效应，对于基质效应严重的目标化合物的检测还需进一步净化。相较于液液萃取等净化方式，固相萃取柱的净化方式可以有效保留目标物，除掉多余杂质，而且操作快捷，因此选取固相萃取柱对其进行进一步富集、除杂。

图10 固相萃取柱对瓜尔胶水解的影响Fig. 10 Effect of solid phase extraction column on the hydrolysis of guar gum

净化过程中，不同固相萃取柱类型会对目标化合物有不同程度的保留，在实验过程中，为了得到净化、富集效果都比较好的结果，考察不同固相萃取柱对酶解物三糖的净化效果。基于酶解物三糖极性弱、易溶于水，不易溶于有机溶剂的性质，实验选取HLB、C18、中性氧化铝柱3种固相萃取柱进行对比。分别取用含0.3%瓜尔胶的猪肉、羊肉、牛肉的酶解液，经过3种固相萃取柱净化，结果如图10所示。结果表明：中性氧化铝柱作为一种能够有效去除样品中脂肪和蛋白质的SPE小柱，能够明显降低基质效应，实验结果表明其对酶解物三糖有较好的净化效果，因此本方法选取中性氧化铝固相萃取柱作为净化小柱。

2.2.7 定容溶剂的选择

定容溶剂的选择会影响目标化合物的峰形和离子化效率，因此对定容溶剂进行优化。经过净化后，溶液为水系，可以增加有机溶剂，以提高目标物的离子化效率，本方法选用乙腈，乙腈不仅可以沉淀蛋白，增加净化效果，且能与色谱流动相保持一致，可以改善峰形。如图11所示，分别向含0.3%瓜尔胶的猪肉酶解液中增加乙腈体积分数，并折算相对含量，在乙腈体积分数约为40%～60%之间时，离子化效率好，相对含量最高，且峰形良好。

图11 定容溶剂对瓜尔胶水解的影响Fig. 11 Effect of amount of acetonitrile added to enzymatic hydrolysate of pork on the hydrolysis of guar gum

2.3 分析特征量

2.3.1 基质效应

基质效应是由与被分析物一起流出的其他内源性物质造成的，例如盐类、胺类、脂肪酸、甘油酸酯等，这些干扰物与目标化合物共同流出，可影响待分析物的雾化、挥发、裂分、化学反应及带电过程，导致进入质谱的离子减少（离子抑制）或增多（离子增强），从而影响定量结果的可靠性和准确性。

通过绘制溶剂标准曲线和基质匹配标准曲线，按照[（基质匹配标准曲线的斜率-溶剂标准曲线的斜率）/溶剂标准曲线的斜率]×100评价畜肉的基质效应大小。结果为负表示基质抑制效应，结果为正表示基质增强效应。当基质效应为-20%～20%时为弱基质效应；基质效应为-50%～-20%或20%～50%时为中等基质效应；当基质效应小于-50%或大于50%时为强基质效应。分别绘制质量浓度范围为0～50 μg/mL的溶剂标准曲线和猪肉、牛肉、羊肉基质匹配标准曲线，酶解物三糖的基质效应由表2可见，3种基质中基质效应在-96.04%～-97.17%之间，此结果表明本实验的基质效应会对实验结果产生影响，需通过基质曲线校正基质效应的影响。因此本实验通过配制基质标准曲线扣除基质带来的影响。

表2 酶解物三糖的基质效应Table 2 Matrix effect of the trisaccharide

针对猪、牛、羊基质中，评价基质匹配曲线及基质前加标曲线中基质效应的影响，分别使用基质匹配曲线、空白基质加标曲线绘制校正曲线，线性范围约为0～50 μg/mL，曲线相关系数如图12a～c所示，空白基质加标的标准曲线与基质匹配曲线相差较大，为能获得良好的回收率，选用空白基质加标的方式制作标准曲线。因瓜尔胶水溶液为悬浊液，采用悬浊液的方式加标，线性不佳，因此本方法采用配制含瓜尔胶的基质方式制作曲线。

基质前加标标准曲线能够对前处理过程的影响进行校正，但是由于在实际检测过程中无法针对每一个基质均制备基质前加标校正曲线，因此其无法完全校正基质效应对目标物的干扰。为考察猪牛羊基质曲线的基质效应影响，选取多种空白基质，配制含瓜尔胶的基质配置标准曲线，结果如图12d所示，不同基质的标准曲线相差较小，在检测过程中，可选用某一种基质制备标准曲线。

图12 不同基质标准曲线Fig. 12 Standard curves of different substrates

2.3.2 线性、检出限和定量限结果

基质加标标准曲线，分别称取含2 g/kg瓜尔胶的基质0、0.03、0.1、0.2、0.4、0.8、2 g于50 mL试管中，不足2 g的用空白试样补足至2 g，与样品共同酶解净化，即上机质量浓度为0、0.75、2.5、5、10、20、50 μg/mL，得到酶解物三糖在7 个质量浓度水平下绘制的线性方程及相关系数R2。以3 倍信噪比及10 倍信噪比确定检出限及定量限，结果如表3所示。

表3 酶解物三糖的回归方程、相关系数、检出限、定量限Table 3 Linear equations, correlation coefficients, LODs and LOQs of the trisaccharide in pork, beef and mutton

2.3.3 回收率及精密度结果

瓜尔胶添加水平设定为0.100、0.200、1.00 g/kg。选取3种不同空白基质样品，分别添加不同质量浓度的标准品，然后按照本检测方法进行实际检测，结果如表4所示。实验结果表明瓜尔胶在0.100～1.00 g/kg添加水平回收率范围为85.4%～109.8%。相对标准偏差（变异系数）均小于10%。

表4 瓜尔胶在3种基质中加标回收结果Table 4 The recovery rate results of guar gum in three matrices

3 结 论

本实验建立猪、牛、羊等畜肉中瓜尔胶测定的高效液相色谱-质谱法，样品经β-甘露聚糖酶酶解，加入乙腈沉淀蛋白后离心，上清液经过中性氧化铝柱净化，用液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。该法前处理过程简单，且方法线性范围、精密度及检出限均满足相关标准的要求，该方法可作为打击“注胶”畜肉中瓜尔胶的有效技术手段。该方法的建立弥补了当前针对畜肉中瓜尔胶检测标准的缺失，为打击“畜肉非法注胶”的不法现象提供了有效的监测手段。

瓜尔胶是甘露糖与半乳糖物质的量比约为2∶1的半乳糖甘露聚糖，但半乳甘露聚糖不仅包括瓜尔胶，还包括甘露糖、半乳糖比例与瓜尔胶相同或不同的胶；甘露糖、半乳糖比例与瓜尔胶相近的有田菁胶、胡芦巴胶、刺槐豆胶等，这几种半乳甘露聚糖在β-甘露聚糖酶的作用下同样可以产生相似的酶解物三糖，但由于畜肉中不允许添加半乳甘露聚糖胶，因此检出酶解物三糖就有添加半乳甘露聚糖胶的风险，可以用以打击非法添加；本实验可以解决已知添加某种胶（如瓜尔胶）时添加量的测定，当添加2种或2种以上半乳甘露聚糖胶时只能计算总量（以某一种胶计算）。