超高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶中24种真菌毒素

丁学妍，邵瑞婷，张涵璐

（北京市食品安全监控和风险评估中心（北京市食品检验所），北京 100041）

真菌毒素是霉菌等真菌在其所污染的食品中产生的有毒次生代谢产物，可广泛污染农作物、食品及饲料等植物源性产品[1]。目前已知的真菌毒素种类已经有400种，主要有黄曲霉毒素、镰刀菌毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、伏马菌素等，近期的研究也发现在谷物和饲料中出现了一些高污染率的“新兴真菌毒素”[2-3]，其中的交链孢霉毒素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇等引起了广泛关注[4]。交链孢霉毒素是由交链孢霉产生的一类有毒代谢产物，已发现70多种，其中交链孢酚、交链孢酚单甲醚、交链孢菌酮酸和腾毒素是食品中最常检测到、污染水平较高、危害较大、最具有代表性的交链孢毒素[5-7]。目前，国内外还没有食品中交链孢霉毒素的限量标准和相应的标准检验方法[8]，但是在小麦、蔬菜、水果及其制品中均检出了该类毒素[9-11]。正是由于真菌毒素普遍存在的污染状况，特别是曲霉菌属（主要分泌黄曲霉毒素、赭曲霉毒素等）、镰孢菌属（主要分泌玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、T-2毒素、串珠镰孢菌毒素）在粮谷和饲料中高频的检出，及对新兴毒素的日益关注，都提示真菌毒素对人畜健康存在着潜在的安全风险。已有研究证实，真菌毒素不仅可通过食入、吸入或皮肤接触进入人体内，具有强毒性、致癌、致畸和致突变等作用，还会通过与人和动物机体内DNA、RNA结合并抑制其合成蛋白质及各种酶类。细胞结构的破坏，抑制了机体的免疫力，引发人类和动物的急性或慢性中毒，损害机体的肝脏、肾脏、神经组织、造血组织及皮肤组织等，会对人畜健康造成极大威胁[12-16]。

牛乳是最古老的天然饮料之一，被誉为“白色血液”，其营养丰富，是人体钙质的最佳来源，其制品更是成为了大众餐桌上不可或缺的一员。而真菌毒素在植物性饲料原料中普遍存在污染，有研究通过检测来源于我国某大型公司的分布于7 省份、9 个奶牛场的精料、国产燕麦、玉米青贮和全混合日粮100余份样品，结果发现玉米赤霉烯酮、T-2毒素、伏马毒素及呕吐毒素均处于严重污染水平[17]。2021年，受极端气象影响原料小麦和玉米的霉菌毒素污染风险显著增加，这一异常情况的风险直接造成了奶牛中毒素高污染的情况，给奶牛养殖安全带来严重影响[18-20]，造成牛乳中潜在的真菌毒素污染，食入被污染的食品后会对人体造成不可逆转的危害。虽然多国对真菌毒素最高残留量进行了限制，但在食品中的限量标准主要集中在谷物、坚果及其制品等类别上，而对于乳及乳制品中真菌毒素的限量要求主要集中在黄曲霉M1上，对其他真菌毒素的限量要求相对缺失[21-22]，目前真菌毒素检测方法主要有高效液相色谱法[23-24]、液相色谱-串联质谱法[25-27]、酶联免疫法[24]和放射免疫法[28]等。大部分检测方法为单类目标物的测定，对多种毒素同时检测的能力有限[29]，不能满足同时检测多组分目标物的快速检测要求。而样品的前处理方法主要以免疫亲合柱净化为主[23,30]，由于免疫亲合柱具有较强的选择性且价格较高，不能满足不同类别多种毒素的检测，当下有必要开发和建立快速、高效、高通量的检测方法，以及时应对突发的食品安全事件，为食品检测提供高效、准确的技术支撑。故本方法采用基质分散固相萃取的方式进行净化，以解决此问题。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈、甲醇、乙酸铵（均为色谱纯） 美国Thermo Fisher公司；甲酸（质谱级） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；β-葡萄糖苷酸/硫酸酯复合酶 德国默克公司；多功能净化柱 美国Romer公司；无水硫酸镁国药集团化学试剂有限公司；中性氧化铝 美国CNW公司；PSA、弗罗里硅土、C18美国Agilent公司。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、13C17黄曲霉毒素B1、13C17黄曲霉毒素B2、13C17黄曲霉毒素G1、13C17黄曲霉毒素G2、伏马毒素B1、伏马毒素B2、伏马毒素B3、13C34伏马毒素B1、13C34伏马毒素B2、13C34-伏马毒素B3、T-2毒素、HT-2霉素、交链孢霉单甲基醚、交链孢酚、腾毒素、细交链孢菌酮酸标准品 美国ROMER公司；黄曲霉毒素M1、赭曲霉毒素A标准品 北京曼哈格生物科技有限公司；α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮标准品 德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 仪器与设备

ACQUITYTM超高效液相色谱仪-TQS质谱仪 美国Waters公司；T10BS25均质器 德国IKA公司；高速冷冻离心机、MAXQ5000恒温振荡摇床 美国Thermo Fisher公司；DL1028H超声波提取仪 德国Banoelin公司；ME203千分之一电子天平 瑞士梅特勒公司。

1.3 方法

1.3.1 标准品配制

精确称取各类固体标准品适量，分别置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成1 mg/mL的标准储备溶液，避光、-18 ℃保存。

精密量取各类液体标准品适量，分别置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成1 mg/mL的标准储备溶液，避光、-18 ℃保存。

精密吸取各类外标标准储备溶液，用乙腈定容至10 mL，配制成含交链孢霉单甲基醚、交链孢酚、腾毒素、细交链孢菌酮酸2 μg/mL，玉米赤霉烯酮、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇1 μg/mL，伏马毒素B17 μg/mL，伏马毒素B2、伏马毒素B33 μg/mL，脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇10 μg/mL，黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G20.03 μg/mL，黄曲霉毒素M10.005 μg/mL，赭曲霉毒素A 1 μg/mL，T-2毒素 5 μg/mL，HT-2霉素10 μg/mL的混合外标标准溶液，避光、-18 ℃保存。

精密吸取各类内标标准储备溶液，用乙腈定容至10 mL，配制成含13C17黄曲霉毒素B1、13C17黄曲霉毒素B2、13C17黄曲霉毒素G1、13C17黄曲霉毒素G2、13C34伏马毒素B1、13C34伏马毒素B2、13C34-伏马毒素B31 μg/mL的混合内标标准溶液，避光、-18 ℃保存。

准确吸取混合外标标准溶液0.1 mL用乙腈定容至10 mL，配制成混合外标标准中间液，现用现配。

分别吸取混合外标标准中间液0.01、0.02、0.05、0.08、0.1、0.2 mL，各加入混合内标标准溶液0.01 mL，用空白基质试样溶液定容至1 mL，配制成混合标准溶液系列工作液。

混合标准使用液：吸取混合外标标准中间液0.5 mL，混合内标标准溶液0.1 mL于10 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度线，混匀，备用。

1.3.2 样品前处理

称取5 g（精确到0.01 g）混匀试样，置于50 mL具塞离心管中，加入混合内标标准溶液0.05 mL，4 mL pH 5.2的乙酸铵溶液，于37 ℃酶解16 h，静置室温，加入16 mL乙腈涡旋混匀后，超声提取20 min，以10 000 r/min冷冻离心10 min，待用。

称取0.15 g C18+0.15 g多功能净化柱下层粉末+0.05 g硫酸镁于10 mL具塞离心管中混匀，随后加入4 mL提取后的样液上清液，涡旋振荡30 s后，5 000 r/min冷冻离心2 min。将全部上清液转移至干净的玻璃试管中，于40 ℃氮气吹至近干。残留物用1 mL 50%乙腈溶液（体积分数）复溶，涡旋混匀后，过0.22 μm微孔滤膜，供仪器检测。

空白基质试样溶液：称取8 个与试样等量的空白基质试样，不加入混合内标标准溶液，与试样同批同法处理，制得空白基质试样溶液，备用。

1.3.3 色谱条件

ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱温40 ℃；样品室温度15 ℃；进样体积10 μL；流速0.3 mL/min；流动相：A为乙腈、B为0.1%甲酸；梯度洗脱程序：0～1 min，10% A，90% B；1～4 min，10%～50% A，90%～50% B；4～6 min，50%～60% A，50%～40% B；6～9 min，60%～80% A，40%～20% B；9～10 min，80%～90% A，20%～10% B；10～12 min，90% A，10% B；12～12.1 min，90%～10% A，10%～90% B；12.1～15 min，10% A，90% B。

1.3.4 质谱条件

采用多反应监测电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）检测，毛细管电压3.0 kV，锥孔电压30 V，离子源温度350 ℃，脱溶剂气温度500 ℃，脱溶剂气流速650 L/h，锥孔气流速150 L/h，碰撞气流速0.15 mL/min，其他质谱条件参数见表1。

表1 24种真菌毒素多反应监测参数Table 1 Mass spectrometric parameters for the twenty-four mycotoxins

续表1

1.3.5 目标物的确证计算

采用超高效液相色谱-串联质谱属于低分辨质谱，根据欧盟指令2002/657/EC，规定低分辨率质谱需满足4 分，即选取1 个母离子（1 分）和2 个子离子（各1.5 分）用来确证化合物。在本实验方法条件下24种化合物的检测结果都能够满足此要求，符合对目标化合物的确证准则。

本实验按照仪器条件测定样品和混合标准溶液，样品的质量色谱峰保留时间与混合标准溶液一致，且定性离子对相对丰度与浓度相当混合标准溶液的相对丰度一致，则判断样品中存在相应的被测物。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂选择

分别用甲醇、乙腈、乙酸乙酯、叔丁基甲基醚4种有机溶剂对牛奶样品中24种化合物进行提取条件实验。结果表明，甲醇有一定的提取效果，但出现乳化现象，回收率不足40%；乙酸乙酯及叔丁基甲基醚作为提取试剂，乳化现象更为明显，无法达到提取效果；采用乙腈作为提取溶剂，蛋白沉淀效果明显，目标物回收率范围在85%～110%之间，具有显著的优势，故本研究选取乙腈作为提取溶剂。

2.2 基质分散剂的确定

牛奶中含有大量脂肪、蛋白、维生素、磷脂等，这些物质对检测会造成比较大的干扰，故选择净化剂时都要考虑到，本实验选择多功能净化柱、PSA、C18、中性氧化铝、弗罗里硅土作为净化填料，无水硫酸镁作为助剂，进行实验摸索。

分别称取0.2 g PSA、C18、中性氧化铝、弗罗里硅土、多功能净化柱上层粉末、多功能净化柱下层粉末于10 mL具塞管中，各加入1 mL混合标准使用液，涡旋振荡30 s后，以5 000 r/min冷冻离心2 min，上清液过0.22 μm微孔滤膜，供仪器检测，得到24种真菌回收率，见图1a。结果表明，C18、多功能净化柱下层粉末对24种真菌毒素都能回收，故主要选择这2种填料用于样品净化的主要填料。

再分别称取多功能净化柱下层粉末+C18（0.1 g+0.1 g）、多功能净化柱下层粉末+C18（0.15 g+0.15 g）、多功能净化柱下层粉末+C18（0.2 g+0.2 g）、多功能净化柱下层粉末+C18+PSA（0.2 g+0.2 g+0.05 g）、多功能净化柱下层粉末+C18+无水硫酸镁（0.1 g+0.1 g+0.05 g）、多功能净化柱下层粉末+C18+无水硫酸镁（0.15 g+0.15 g+0.05 g）、多功能净化柱下层粉末+C18+无水硫酸镁（0.15 g+0.2 g+0.05 g）、多功能净化柱下层粉末+C18+无水硫酸镁（0.2 g+0.2 g+0.05 g）、多功能净化柱下层粉末+C18+无水硫酸镁（0.2 g+0.25 g+0.05 g）、多功能净化柱下层粉末+C18+无水硫酸镁+PSA（0.2 g+0.2 g+0.05 g+0.05 g）于10 mL具塞管中，各加入1 mL混合标准使用液，涡旋振荡30 s后，5 000 r/min冷冻离心2 min，上清液过0.22 μm微孔滤膜，供仪器检测，得到24种真菌回收率，见图1b。结果表明，C18+多功能净化柱下层粉末+无水硫酸镁（0.15 g+0.15 g+0.05 g）对24种真菌有更好的回收率，故在本研究中，选取C18+多功能净化柱下层粉末+无水硫酸镁（0.15 g+0.15 g+0.05 g）作为分散基质固相萃取柱。

2.3 定容溶剂选择

吸取混合外标标准中间液0.05 mL+混合内标标准溶液0.01 mL，分别用50%、80%、100%乙腈溶液（体积分数）稀释配制成同一浓度混合标准溶液，供仪器检测，在相同参数条件下，结果如图2所示，50%乙腈作为定容液可以得到更好分离度且峰形尖锐。故在本研究中，选取50%乙腈作为定容溶剂。

图1 24种真菌毒素回收率Fig. 1 Effect of matrix dispersant on recoveries of 24 mycotoxins

图2 以黄曲霉毒素B2为例的离子谱图Fig. 2 Ion chromatograms of AFB2

2.4 流动相选择

吸取混合外标标准中间液0.05 mL+混合内标标准溶液0.01 mL，用50%乙腈溶液（体积分数）配制成混合标准溶液，供仪器检测，对比2 组流动相，分别为乙腈-水，乙腈-0.1%甲酸，在相同参数条件下，结果如图3所示，乙腈-0.1%甲酸可以更好分离各种物质且峰形尖锐，故选取乙腈-0.1%甲酸作为流动相。

图3 不同流动相条件下24种化合物的总离子流图Fig. 3 Total ion current chromatograms of 24 compounds under different mobile phase conditions

2.5 色谱条件的优化

2.5.1 液相色谱条件优化

比较ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）和ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），在相同参数条件下，结果如图4所示，BEH C18色谱柱拖尾现象明显，且无法实现多种化合物的基线分离；而HSS T3色谱柱的峰形尖锐，且分离效果明显优于BEH C18色谱柱。故在本实验中，选择HSS T3色谱柱。

图4 不同色谱柱组成条件下赭曲霉毒素A、T2-毒素为例的离子色谱图Fig. 4 Ion chromatograms of OTA and T2 using different columns

2.5.2 质谱条件优化

采用ESI，不接色谱柱，标准品直接注射状态下，分别将100 μg/L标准溶液在正离子（ESI+）和负离子（ESI-）模式下进行全扫描以选择适当的电离方式，结果表明，玉米赤霉烯酮类（α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮）、细交链孢菌酮酸、交链孢酚8种真菌毒素在负离子模式下灵敏度较高，其他16种真菌毒素均在正离子模式下灵敏度较高。故本实验选取正、负离子2种模式。

2.6 方法学实验

2.6.1 检出限、定量限与线性范围结果

分别吸取混合标准中间液0.01、0.02、0.05、0.08、0.1、0.2 mL，用空白基质试样溶液定容至1 mL，配制成混合标准溶液系列工作液，设置进样量为10 μL，浓度从低到高进样，超高效液相色谱-串联质谱分析。在多反应监测模式下，以定量离子峰面积（峰面积比）作图，得到标准曲线回归方程。以待测化合物定性离子对的重构离子色谱峰的信噪比不小于3确定方法检出限，以定量离子对的重构离子色谱峰的信噪比不小于10确定方法定量限，结果见表2。结果表明，24种化合物在线性范围内线性关系良好，线性相关系数平方（R2）均大于0.985，能满足定量分析的要求。

表2 24种真菌毒素检出限、定量限与线性关系Table 2 Limits of detection and quantitation and calibration curves of 24 mycotoxins

2.6.2 样品的加标回收率

在5.0 g牛奶样品中加入含有24种真菌毒素标准混合溶液，应用优化好的方法进行提取、净化分离和确证，回收率范围为71.0%～123.0%，相对标准偏差均小于10%。结果表明，各化合物在不同添加水平均得到满意的回收率和较好的方法重复性。以交链孢霉单甲基醚、交链孢酚、腾毒素为例的离子色谱图如图5所示。

图5 以交链孢霉单甲基醚（a）、交链孢酚（b）、腾毒素（c）为例的样品加标离子色谱图Fig. 5 Ion chromatograms of spiked samples with AME (a),AOH (b) and TEN (c)

3 结 论

通过比对不同提取试剂、基质分散剂、定容液、流动相及色谱柱确定最终实验条件，采用分散基质固相萃取净化，建立了牛奶中24种真菌毒素的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。与其他文献相比，该方法检测通量大，前处理简便高效，实用性强，可满足牛奶中24种真菌毒素的快速筛查和定量的要求，已在日常风险监测实验中得到良好的应用。