固相萃取-气相色谱质谱法测定食品中9种大麻素

唐庆强，夏林兵，曹 丹，杨 方，吴春灯，薛昆鹏

（1.福州海关技术中心，福建 福州 350001；2.三明海关综合技术服务中心，福建 三明 365001；3.杭州国际旅行卫生保健中心（杭州海关口岸门诊部），浙江 杭州 310016；4.金华海关综合技术服务中心，浙江 金华 321001；5.浙江月旭材料科技有限公司，浙江 金华 321001）

大麻素是大麻植物中天然含有的一类萜酚类化合物[1]，其中Δ9-四氢大麻酚（Δ9-tetrahydrocannabinol，Δ9-THC）具有较强的精神活性和致幻成瘾作用，被《麻醉品单一公约》[2]、《精神药物公约》[3]和《联合国禁止非法贩运麻醉药品和精神药物公约》[4]等国际公约列为国际管制的毒品。合成大麻素是一类药理、生理作用与Δ9-THC相似的化合物，最初由科学家以治疗疾病的目的发明出来，但最终因其具有精神活性而被滥用[5]。合成大麻素在实验室内就能够人工合成，因此也被称为“策划药”或“实验室毒品”，其吸食成瘾效果是天然大麻的4～5 倍[6]，现已成为使用量最大的新精神活性物质种类[7]。近年来，国际上对大麻管控的态度有所变化，大麻合法化运动在部分国家迅速蔓延[8]，世界卫生组织也在2018年向联合国麻醉药品委员会提出解除对低THC含量的大麻及产品列管的建议[9]。但我国和世界上其他国家对大麻制品，特别是合成大麻素都采取严格管控的措施，我国《麻醉药品品种目录》、《精神药品品种目录》[10]、《非药用麻醉药品和精神药品管制品种增补目录》[11]和历次增补公告[12-13]中，先后将48种合成大麻素和7种合成大麻素化学结构通式列为管制品。但不法分子为逃避打击，不断修改化合物的结构从而开发出新种类的合成大麻素，目前已从第一代的萘甲酰基吲哚类发展至第八代的吲哚酰胺类[14-15]。不仅如此，不法分子还将大麻素喷洒在香料或药草上晾干，以减少被识别的概率，甚至还伪装成奶茶、咖啡、饼干、开心果、饮料、酒或糖果等各种食品[16-19]，具有极强的隐蔽性和社会危害性。

当前检测大麻素的方法大多针对毛发[20-21]、血液[22-23]、尿液[24-25]和疑似毒品[26-27]等基体，涉及食品基质的研究往往集中在THC、大麻二酚（cannabidiol，CBD）和大麻酚（cannabinol，CBN）等天然大麻素上[28-30]，对少数特定食品中合成大麻素[31-32]结构、种类的研究较少。现有研究无法满足当前已出现在多种食品中非法添加合成大麻素的现状。

本研究结合已公布的非法添加报道，选择有代表性的食品基质，以9种常见的大麻素为分析对象，结构上涵盖了天然大麻素和萘甲酰基吲哚、环己基苯酚、苯酰基吲哚和吲哚酰胺类等多种类型的合成大麻素（表1），对操作条件进行优化，建立适用于多种食品基质中大麻素的固相萃取-气相色谱质谱分析方法。

表1 9种大麻素信息Table 1 Information about nine cannabinoids tested in this study

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Δ9-THC、CBN、CBD、戊基-3-(4-乙基-1-萘甲酰基)吲哚（JWH-210）、顺式-5-(1,1-二甲基庚基)-2-[(1R,3S)-3-羟基环己基]苯酚（CP-47497）、1-(5-氟戊基)-3-(1-萘甲酰基)-1H-吲哚（AM2201）、戊基-3-(4-甲氧基苯甲酰基)吲哚（RCS-4）、N-(1-氨甲酰基-2-甲基丙基)-1-(环己基甲基)吲唑-3-甲酰胺（AB-CHMINACA）和N-(1-氨甲酰基-2,2-二甲基丙基)-1-戊基吲唑-3-甲酰胺（ADB-PINACA）标准溶液（质量浓度均为1 mg/mL）天津阿尔塔科技有限公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯） 德国Merck公司；Captiva EMR-Lipid固相萃取柱（100 mg，3 mL） 美国安捷伦科技公司；Oasis二乙烯苯-N-乙烯基吡咯烷酮（HLB）固相萃取柱（60 mg，3 mL） 美国Waters公司；其他试剂均为国产分析纯或优级纯；实验用水符合GB/T 6682—2008《分析实验室用水规格和试验方法》中规定的一级水。

橄榄油、猪肉、牛奶、蜂蜜、面包、茶叶、大豆、可乐和啤酒均购自当地超市。火麻仁、火麻籽、火麻茶、火麻糊、火麻油、火麻膏和火麻粉均购自广西火麻食品专卖店。

1.2 仪器与设备

Trace1300/ISQ7000型气相色谱-质谱联用仪 美国赛默飞世尔科技公司；3-18K高速离心机 德国Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

混合标准溶液：移取适量9种大麻素标准溶液，用甲醇稀释配制成1.0 μg/mL的混合标准工作液，于-20 ℃避光保存。

基质标准曲线：选择与被测样品性质相同或相似的空白样品按照1.3.2节进行前处理，得到空白基质溶液。精确吸取一定量的混合标准溶液，用空白基质溶液逐级稀释成质量浓度为10、20、50、100、200 μg/L和500 μg/L的基质标准曲线。

1.3.2 样品前处理

1.3.2.1 样品提取

橄榄油：称样1.00 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，涡旋混匀30 s，50 ℃超声提取15 min，10 000 r/min离心5 min，取5 mL上清液待净化。

大豆、猪肉、面包、蜂蜜、茶叶：称样1.00 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入10 mL甲醇，涡旋混匀30 s，50 ℃超声提取15 min，10 000 r/min离心5 min，取5 mL上清液；加入5 mL水稀释后涡旋混匀，10 000 r/min离心5 min，取全部上清液待净化。

牛奶：称样1.00 g（精确至0.01g）于50 mL离心管中，加入5 g氯化钠和10 mL甲醇，涡旋混匀30 s，50 ℃超声提取15 min，再加入1 g三氯乙酸，静置15～20 min沉淀蛋白质后，10 000 r/min离心5 min，取5 mL上清液；加5 mL水稀释后涡旋混匀，10 000 r/min离心5 min，取全部上清液待净化。

可乐、啤酒：称样1.00 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入5 g氯化钠和10 mL甲醇，涡旋混匀30 s，50 ℃超声提取15 min，10 000 r/min离心5 min，取5 mL上清液，加5 mL水稀释后涡旋混匀后待净化。

1.3.2.2 样品净化

橄榄油：将待净化液转移至事先用2 mL乙腈活化过的EMR固相萃取柱中，自然重力流出后，用5 mL乙腈淋洗小柱，减压抽干30 s。上样和洗脱流速均应小于1 mL/min。收集全部流出液，在40 ℃下氮吹至干，加入1 mL甲醇溶液，涡旋混匀30 s，超声3 min，过0.22 μm滤膜后待测定。

其他样品：将待净化液转移至事先用5 mL甲醇和5 mL水活化过的HLB固相萃取柱中，自然重力流出后，用5 mL 50%甲醇溶液淋洗小柱，弃去全部淋洗液并减压抽干30 s，用5 mL乙腈洗脱小柱。上样和洗脱流速均应小于1 mL/min。收集全部洗脱液，在40 ℃下氮吹至干，加入1 mL甲醇溶液，涡旋混匀30 s，超声3 min，过0.22 μm滤膜后待测定。

1.3.3 固相萃取气相色谱-质谱分析

1.3.3.1 色谱条件

HP-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度290 ℃；进样量1.0 μL；不分流进样；载气为高纯氦气（99.999%）；流速为恒定流量1.5 mL/min；升温程序：初始70 ℃，保持2 min；以10 ℃/min升至180 ℃；再以15 ℃/min升至300 ℃，保持9 min。

1.3.3.2 质谱条件

电子电离源；电离能量70 eV；离子源温度310 ℃；传输线温度290 ℃；溶剂延迟时间7.5 min；检测方式为选择离子监测。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

大麻素主要为非极性和弱极性化合物，本实验比较了中等极性的DB-17MS色谱柱和非极性的HP-5MS色谱柱测定9种大麻素的效果。结果表明，两种色谱柱均可实现9种大麻素的全部分离；但除JWH-210外，使用HP-5MS色谱柱测定的峰面积均高于DB-17MS，平均峰面积为后者的1.8 倍。这可能与HP-5MS色谱柱（固定相）对分离的目标物具有选择宽泛的特点，对非极性和弱极性化合物的分离效果更佳有关。考虑到同时分析多种目标物的需要，选择HP-5MS色谱柱进行测定，选择离子流色谱图如图1所示。

图1 9种大麻素标准品的选择离子流色谱图Fig. 1 Selected ion monitoring chromatogram of mixed standard of nine cannabinoids

考察了250～310 ℃进样口温度下9种大麻素峰面积情况。如图2所示，随着进样口温度的升高，9种大麻素的峰面积呈现整体上升趋势，在进样口290～300 ℃下达到最高。为进一步明确最佳的进样口温度，在290 ℃和300 ℃的进样口温度下分别连续进样6 次，比较精密度，结果显示，290 ℃进样口温度下峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为2.5%～5.8%，300 ℃进样口温度下峰面积的RSD为1.8%～11.2%。因此，选择290 ℃进样口温度作为实验条件。

图2 不同进样口温度下的峰面积Fig. 2 Peak areas at different inlet temperatures

2.2 质谱条件优化

比较了质谱中全扫描和选择离子监测模式同时分析9种大麻素的情况。先用单级质谱的全扫描模式获得9种目标物的总离子流色谱图，确定每种大麻素的保留时间，再用选择离子监测模式建立5 组多通道时间段，每个时间段内扫描1～3 个化合物，每种化合物选择定量离子1 个，定性离子2～3 个，得到9种大麻素的离子信息，如表2所示。

表2 9种大麻素的保留时间和监测离子Table 2 Retention times and monitoring ions of the nine cannabinoids

2.3 提取条件的优化

考察了甲醇和乙腈这两种文献中检测大麻最常用的提取溶剂[22-28]，使用空白样品加标的方式比较两种溶剂对大麻素的提取效果，结果表明，两种溶液均有较好的提取效果，橄榄油基质中乙腈对各种大麻素的平均提取回收率为93.7%，高于甲醇提取时的85.0%；而其他基质中甲醇对各目标物的提取回收率均大于90%，高于乙腈的74.3%。为验证这一结论，使用天然含有Δ9-THC、CBD、CBN的火麻油、火麻仁和火麻茶样品，用峰面积比较两种溶剂的提取效果。由图3可知，实际样品中的提取效果与上述空白样品加标实验结果一致。因此，选用乙腈作为油脂类样品的提取溶剂，用甲醇作为其他样品的提取溶剂。

图3 不同提取溶剂对火麻油、火麻仁和火麻茶的提取效果比较Fig. 3 Comparison of extraction efficiencies of different extraction solvents for hemp oil, hemp seed and hemp tea

还比较了涡旋提取、均质提取和超声提取等方式的提取效率，结果表明，在相同的提取时间下，超声提取对各种大麻素的提取效率均高于90%，优于涡旋振荡和均质提取的效率。继续对超声提取的时间和温度进行优化，由图4可知，超声温度对各大麻素的影响差别不大，整体上当超声温度高于50 ℃时，峰面积趋于稳定；当超声时间大于15 min时，目标物的峰面积基本不再增加。因此，最佳提取条件为：使用乙腈作为油脂类样品的提取溶剂，用甲醇作为其他类别样品的提取溶剂，并在50 ℃下超声提取15 min。

图4 不同超声时间和超声温度对提取效果的影响Fig. 4 Effect of ultrasonic temperature and time on the recoveries of nine cannabinoids

2.4 净化方法的优化

根据基质的特点和目标物的结构特性结合参考相关文献，使用空白样品加标的方式，比较了中性氧化铝小柱（Alumina-N）[33]、EMR固相萃取柱和凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）[34]对橄榄油样品的净化效果，还比较了HLB固相萃取柱和QuEChERS基质分散萃取[29-32]对其他基质样品的净化效果。

由图5a可知，对于油类基质样品，Alumina-N回收率一般，EMR固相萃取柱和GPC净化方法都能取得较好的回收率，但GPC净化操作繁琐、耗时长且需额外增加凝胶渗透色谱仪设备，所以选择EMR固相萃取柱净化油类样品。由图5b可知，对于其他基质的样品，HLB固相萃取柱的回收率优于QuEChERS方法，所以选择HLB固相萃取柱净化其他基质样品。在此基础上，进一步比较了BIOSIL、RayCure、Agela、BESEP等多个不同品牌的固相萃取柱和不同体积分数甲醇溶液和乙腈溶液作为淋洗液和洗脱液的结果，并结合基质效应影响的评估方法，研究了不同淋洗液和洗脱液体积（3～7 mL）对净化效果的影响。结果表明，使用5 mL乙腈淋洗Captiva EMR-Lipid固相萃取柱和使用5 mL 50%甲醇溶液洗脱Oasis HLB固相萃取柱时，能达到较好的回收率和净化效果。

图5 不同净化方式对橄榄油样品（a）和其他基质样品（b）的净化效果Fig. 5 Effects of different purification methods on the recoveries of cannabinoids from olive oil samples (a) and samples of other matrices (b)

2.5 内外标法选择

比较了外标法和内标法在定量上的差别。当使用外标法定量时，在各目标物1、2、10 倍定量限（limit of quantitation，LOQ）3 个添加浓度水平的平均回收率为65.2%～117.9%。当使用Δ9-THC-D3作为内标定量时，各目标物的平均回收率为80.1%～142.7%，回收率普遍偏高。这可能是由于各种大麻素在结构和性质上存在差别，而只使用一种Δ9-THC的同位素内标时，无法同时对多种大麻素进行结果校正。由于很难获得每种大麻素的同位素内标，外标法回收率的结果效果令人满意，因此，最终采用外标法进行定量分析。

2.6 基质效应考察

气相色谱-质谱分析时，由于待测成分的离子化效应被改变，导致目标化合物发生离子增强或抑制现象。本实验涉及的食品基质较多，不同基质对目标物会产生不同的基质效应。参考Gonzalez等[35]的方法，使用甲醇配制的标准曲线斜率（kA）和用空白基质配制的相同浓度标准曲线斜率（kB）进行比较，按基质效应/%＝（kB-kA）/kA×100式子计算各种样品的基质效应。|基质效应|＜20%时为弱基质效应；20%＜|基质效应|＜50%时为中等强度基质效应；|基质效应|＞50%时为强基质效应。结果表明，各种基质食品中9种大麻素整体呈现出基质增加，且面包、大豆、橄榄油样品的基质效应相对较高，这可能与其油脂含量高有关。对此，根据降低基质效应的方法[36]，采取优化净化条件、改善稀释过程和使用空白基质配制标准曲线等方法减少和校正基质效应的影响，如图6所示，各种基质的基质效应值在-21.3%～48.0%之间，均处在中等强度或弱基质效应范围内，可以满足检测方法的要求。

图6 9种不同基质食品中的基质效应情况Fig. 6 Matrix effect of the cannabinoids from nine different matrices

2.7 标准曲线、检出限（limit of detection，LOD）和LOQ分析

精密吸取9种大麻素混合标准溶液，用甲醇稀释成质量浓度为10、20、50、100、200 μg/L和500 μg/L的系列混合标准工作溶液，按质量浓度由低到高的顺序进样分析。以9种大麻素化合物的峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，获得线性方程和相关系数（R2）。由表3可知，9种大麻素在10～500 μg/L范围内呈良好线性相关，R2均在0.999 2以上，能满足测试工作的需求。在各阴性基质的样品中分别添加1～100 μg/L的9种大麻素标准溶液，按优化后前处理方法和仪器条件测定，以定量离子信噪比为3和10时响应定义方法的LOD和LOQ。根据信噪比的结果，部分种类基质样品的LOD和LOQ可以更低，但考虑到操作便捷和使用方便，基于最不灵敏化合物的LOD和LOQ进行了统一，各种基质中大麻素的LOD和LOQ分别为1～15 μg/kg和2.5～50 μg/kg。

表3 9种大麻素的回归方程、R2、LOD和LOQTable 3 Regression equations, correlation coefficients (R2), LODs and LOQs of the nine cannabinoids

2.8 准确度和精密度分析

为验证方法的准确度和精密度，用空白的橄榄油、大豆等9种食品进行加标回收实验，分别添加相当于1、2、10 倍LOQ的9种大麻素标准品，每个水平测定6 次，计算方法的回收率和精密度。由表4可知，9种大麻素在各种食品基质中的平均回收率为65.2%～117.9%，RSD为2.0%～12.7%，说明该方法准确度高、重复性好，能够满足多种食品基质中9种大麻素的定量分析要求。

2.9 实际样品分析

应用建立的方法对市场购买的16种火麻食品进行测定，包括火麻茶、火麻油、火麻膏、火麻糊、火麻粉、火麻仁和火麻籽等。由表5可知，所有火麻食品均未检出合成大麻素，但均不同程度地检出CBD、Δ9-THC和CBN等天然大麻素，其中火麻油中大麻素的整体含量最高；不同品牌火麻油或火麻茶中3种大麻素含量差别较大，这可能与原料、产地、大麻籽用量等有关。

表4 9种大麻素在不同食品中添加回收率和RSD（n＝6）Table 4 Recoveries and RSDs of the nine cannabinoids spiked into different foods (n = 6)

表5 实际样品中大麻素类化合物的检测结果Table 5 Results of determination of cannabinoids in real samples μg/kg

3 结 论

通过优化色谱、质谱条件，建立了固相萃取气相色谱-质谱联用法对多种食品基质中9种大麻素的检测方法，涵盖了多种国内外关注的食品种类。结果表明，该方法操作简单、快速，针对的大麻素种类包括了多种类型的合成大麻素，各种食品中的LOQ为2.5～50 μg/kg，加标的平均回收率为65.2%～117.9%，精密度（RSD）在2.0%～12.7%范围内，均满足国内外限量的要求，具有较好的实用性和适用性，为监控食品中非法添加的大麻素提供了技术支持和监测手段。