基于矿物元素指纹的地理标志羊肉真实性鉴别

齐 婧，李莹莹，姜 锐，张 晨，张顺亮，郭文萍，王守伟

（中国肉类食品综合研究中心，肉类加工技术北京市重点实验室，北京 100068）

地域特色产品所具有的品质特性主要取决于产地的自然因素。经审核批准以地理名称进行命名的产品，受到国家法律或国际条约的相关权利保护[1]。在中国，盐池滩羊、苏尼特羊、巴里坤哈萨克羊都是地理标志羊种。这些羊肉因得天独厚的地理环境培养的独特品质，备受消费者推崇[2]，其价格明显高于普通羊肉。错贴标签或者故意假冒的违法行为会给合法的生产者和消费者带来不利影响。要对地理标志羊肉进行法律保护、维护市场秩序、保障消费者权益，需要一种真实性鉴别和判断技术的支撑。

矿物元素指纹分析被认为是食品产地溯源领域最可靠的技术之一[3-4]，不同地域特色羊肉体内矿物元素的组成受到区域气候条件、生物环境相互作用和生物代谢等的影响而存在指纹差异。目前大量文献报道了应用矿物元素分析进行肉类产地溯源的研究[5-8]，矿物质元素分析技术对于肉类产地溯源可靠，并具有广泛应用前景。基于矿物元素的食品产地溯源研究的思路比较统一：1）样品收集；2）多元素分析法的开发；3）多元素分析数据的积累；4）化学计量学分析数据；5）验证构建模型的有效性；6）实例验证[9]。其中数据分析与建模是关键技术之一，目前的研究都是采用监督模式的判别分析方法和分类算法，例如线性判别分析、偏最小二乘法判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）等[10-16]。判别分析方法的局限性是只适用于收集到样本的种类和范围，更广泛的应用需要非常大的数据量构建系统数据模型。例如，要验证地理标志羊肉盐池滩羊的真实性则需要收集所有的可能欺诈类型，这显然是不现实的，因此该技术用于真实性鉴别的发展受到了限制。

针对某一种高值的地理标志羊肉真实性而言，单分类建模方法具有非常大的应用性能。单分类策略是将真实类视为目标类，将其划定边界生成一个模型，建模时没有其他非真实样本的贡献，在预测阶段，如果未知样本与目标类匹配，则将其视为真实样本，如果不匹配，则为非真实样本[17]。单分类方法主要有类类比软独立建模（soft independent modeling of class analogy，SIMCA）、单分类支持向量机（One-Class SVM）和基于PLS方法等[18]。相较于目前常用的监督分类方法，单分类建模最大的优点是不需要包含所有可能形式的欺诈样本，减少了样本和数据收集的系统工作量，在真实性鉴别领域具有更广泛的应用性能[19]。目前单分类方法主要应用于基于光谱数据的食品认证、原产地确认和真实性鉴别。比如解决基于近红外光谱的橄榄油和蜂蜜的真实性问题[20]，Xu Lu等[21]应用单分类建模手段，通过对近红外光谱数据集的分析，用于安吉白茶的地理产地识别和纯芝麻油的掺假鉴别，以及西湖藕粉的原产地分析[22]。Rodionova等[23]以基于近红外数据鉴别牛至草真实性为实例，验证单分类模型的应用性能，证明其可以成功地应用于揭露各种类型的伪造食品。Meza-Márquez等[24]应用SIMCA分析中红外数据，研究肉糜参杂检测。Vinciguerra等[25]将其应用于基于三维荧光光谱数据的巴西红酒的产地真实性鉴别。单分类建模被认为是一种非常适用于非目标分析的分类器[23]。尽管单分类方法更适合于解决许多实际问题，但是它的应用仍然不多，主要原因之一是这些方法在目前的化学计量学包（包括商业的、免费的和开源的）中缺乏[26]。目前也还没有报道将单分类建模方法应用于我国地理标志羊肉的真实性鉴别中，我国研究还是普遍采用传统的判别手段[27-30]，因此技术停留在只能对所搜集样本种类进行鉴别的瓶颈阶段。

本实验采用电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）仪测定盐池滩羊、巴里坤哈萨克羊、苏尼特羊3种地理标志羊肉矿物元素，分析其矿物元素特征，应用最常用的单分类建模方法SIMCA[19]分别对3种羊肉建模，研究基于矿物元素指纹结合单分类建模方法实现我国地理标志羊肉真实性鉴别。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

所采集的宁夏滩羊样本n=20，哈萨克羊样本n=18，苏尼特羊样本n=15。盐池滩羊采集自宁夏盐池县、巴里坤哈萨克羊采集自新疆巴里坤哈萨克自治县、苏尼特羊采集自内蒙古锡林郭勒盟。采集样品均为7～10 月龄健康羊的后腿肉。同时采集市售16 个普通羊肉样品，用于地理标志羊肉真实性模型验证。样品为羊瘦肉样品，样品采集后，将样品保存在-20 ℃条件下直至处理。

65%硝酸、30%过氧化氢（均为优级纯） 国药集团化学试剂有限公司；多元素标准品（B、Al、Ca、Ti、V、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、As、Se、Rb、Sr、Ba、Tl、Na、Mg、K） 加拿大SCP Science公司；Rh、Re、In、Ge标准品 美国Inorganic Ventures公司。

1.2 仪器与设备

HM100搅拌机 中国Grindertech公司；TOPEX+微波消解系统 中国PreeKem科学仪器有限公司；ICAP RQ ICP-MS联用仪 美国Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

将样品切成小块，并在搅拌机中斩拌均匀。称取约0.500 0 g斩拌均匀的样品，加入6 mL的65%硝酸和2 mL的30%过氧化氢进行微波消解。将消化后的溶液转移到塑料样品管中，并用超纯水（18.2 MΩ·cm，20 ℃）定容至15 mL。每个样品进行2 次平行实验。

1.3.2 样品测定

用ICP-MS测定矿物元素含量（B、Al、Ca、Ti、V、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、As、Se、Rb、Sr、Ba、Tl、Na、Mg、K）。

ICP-MS最佳操作条件如下：射频功率1 550 W，氦气流量4.35 mL/min，石英玻璃同心雾化器，采样时间为0.1 s，重复2 次。Rh、Re、In和Ge的内标溶液用于消除基质效应和仪器偏差。内标溶液为单元素标准溶液配制成质量浓度为10 μg/L的混合溶液。采用外标法进行定量分析，标准曲线的线性回归系数大于0.99。所有结果均为2 次平行测试结果的平均值。

1.4 数据处理

采用SPSS（版本22.0，美国IBM）进行方差分析（ANOVA）、多重比较分析，研究不同地理来源样品中矿物元素数据的差异。用安捷伦Mass Profiler Professional软件进行主成分分析（principal component analysis，PCA）并作三维PCA散点图。使用SIMCA-P（版本14.0，Umetrics AB）对样本数据进行单分类建模，以及测试集的真实性验证。

2 结果与分析

2.1 不同地理标志羊肉中矿物元素含量差异分析

2.1.1 元素含量

表1 不同地理标志羊肉中元素含量水平Table 1 Concentration levels of elements in mutton from different sheep breeds under the protection of geographical indication

测定不同地理标志羊肉样品中B、Al、Ca、Ti、V、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、As、Se、Rb、Sr、Ba、Tl、Na、Mg、K元素含量，有的痕量元素含量低于或接近检出限（检出限数据参照本课题组之前的研究数据[8]），不适用于元素含量的测定和分析，排除含量低于或接近检出限的元素，筛选出Ca、Ti、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、Se、Rb、Sr、Na、Mg、K共13 个元素进行统计分析，结果见表1。由表1可知，羊肉中K含量最高，Na与K相同，也是机体保持渗透压并参与神经兴奋的关键元素，Na是含量第2高的元素，其次是常量元素Mg、Ca、Zn、Fe，其他元素含量较少，各元素的含量水平与文献报道一定范围内存在差异，是由于地区、喂养系统和肉的部位差异引起。变异系数是通过测定同一来源样本的元素含量相对标准偏差评估离散度。如果离散度过大，则意味着来自同一产地羊肉样品含量差异较大，不适合用作溯源变量。从表1看出，筛选的元素离散度相对不大，可以作为溯源变量。

2.1.2 差异分析

图1 各地理标志羊肉元素含量（Z-score标准化）指纹图谱Fig. 1 Fingerprint profile of characteristic elements (Z-score standardized) in geographical indication mutton

为探究不同地理标志羊肉中矿物元素含量的差异，进行方差分析、多重比较分析以及PCA。方差分析结果显示（表1），样品中Na、K、Ca、Fe、Cu、Zn、Se、Rb、Sr和Ti的P值均小于0.05，这表明这10种元素在地区之间具有显著差异。通过多重比较分析比较来自不同产地羊肉样品中元素的平均值，以发现差异来源。需要3种羊肉之间两两比较，方差齐性的元素，选择拜佛伦尼多重比较，方差不齐的元素选择塔姆黑尼多重比较。比较结果显示：苏尼特羊Ca和Ti含量显著高于盐池滩羊和巴里坤哈萨克羊，苏尼特羊的Cu和K含量显著低于盐池滩羊和巴里坤哈萨克羊，巴里坤哈萨克羊中Fe、Zn和Se含量显著高于盐池滩羊和苏尼特羊，盐池滩羊的Na含量显著低于巴里坤哈萨克羊和苏尼特羊，3种羊肉之间的Sb和Sr含量均存在显著差异，盐池滩羊的Sb含量最高，其次是巴里坤哈萨克羊，苏尼特羊最低，苏尼特羊的Sr含量最高，其次是盐池滩羊，巴里坤哈萨克羊Sr含量最低。Rb和Sr作为能显示地球化学行为的元素，其含量因养殖地质环境不同而变化，从而能提供更好的原产地信息。为了将多重比较分析的结果可视化，更直观地看出不同地理标志羊肉之间的矿物元素含量差异，绘制不同地理标志羊肉矿物元素含量指纹图，可见每种羊肉样品都有特征元素含量分布（图1）。因为不同元素含量从μg/kg到g/kg，含量数量级跨度较大，为了在同一量度范围内比较，对数据进行Z-score标准化。

2.1.3 PCA结果

使用ANOVA选择的具有显着区域差异的10种元素进行PCA。由于各个特征之间的数量级存在较大差异，就会使较小的数被淹没，因此PCA前对数据进行了log2转化。前3 个PC的方差贡献率分别为39.35%、21.5%、11.95%，累计方差贡献率为72.8%，认为可以足够解释原始数据信息。由图2可以看出，3种羊肉区分明显，由此可见3种羊肉中矿物元素变量之间存在可分类的差异。

图2 前3 个PC 3D得分散点图Fig. 2 3D score scatter plot of first three principal components PC1,PC2 and PC3

2.2 SIMCA单分类模型的建立与地理标志羊肉样品真实性鉴别

所采集的盐池滩羊15 个样本用于训练集，5 个样本用于测试集，巴里坤哈萨克羊15 个样本用于训练集，3 个样本用于测试集，苏尼特羊12 个样本用于训练集，3 个样本用于测试集。同时采集市售16 个普通羊肉样品，用于地理标志羊肉真实性模型验证。用每种羊肉训练集样本分别建立SIMCA的PCA-Class模型，使用ANOVA选择的具有显著差异的10种元素进行建模，模型PC的个数由Q2（cum）值决定，Q2（cum）表明的是当前主成分数量时总的模型预测能力，当增加的1 个PC不能提升交叉验证的数据质量时，Q2（cum）会下降，因此当Q2（cum）达到最高值时对应的PC个数为最有效PC个数。巴里坤哈萨克羊模型2 个PC，苏尼特羊模型1 个PC，盐池滩羊模型1 个PC。ROC曲线图可反映敏感性与特异性之间关系，其中X轴为特异性，Y轴为敏感度，X越小Y越大，准确率越高。ROC曲线下面积值越接近1，说明预测准确率越高。从图3、4结果看，建立的模型性能优良。图4a、d是以哈萨克羊建立的SIMCA模型，图4b、e是以苏尼特羊建立的SIMCA模型，图4c、f是以滩羊建立的SIMCA模型，其中，红线为95%置信区间临界距离，处于红线下方的样本被认为是建模的羊种，3 个模型中3种羊肉都被准确判别。将测试集带入每种羊肉模型中（图4d、e、f），可以看出每种羊肉的模型均能将真实样品成功鉴别出，其他不属于所验证的地域特色羊肉（欺诈样本）也均被识别。所以地理标志羊肉的矿物元素含量具有明显的特征差异，作为SIMCA模型变量，能够实现地理标志羊肉真实性的100%鉴别准确率。

图3 3 个分类模型的ROC曲线及曲线下面积Fig. 3 Area under the receiver operating characteristic (ROC) curve (AUC)

图4 3种地理标志羊种分类模型预测DModX图Fig. 4 DModX charts for the prediction performance of classification models for three geographical indication sheep breeds

3 结 论

测定3种地理标志羊肉中多种矿物元素含量，筛选出13 个元素作为真实性鉴别分析变量。通过方差分析、多重比较分析以及PCA分析3种羊肉中矿物元素含量之间差异，探究地理标志羊肉中矿物元素指纹特征。用特征矿物元素变量（Na、K、Ca、Fe、Cu、Zn、Se、Rb、Sr和Ti）针对每种地理标志羊肉建立SIMCA模型，研究表明模型性能优良，模型能够从多种欺诈样本中识别真实样本，达到100%鉴别准确率。

本研究探索了基于矿物元素指纹结合单分类建模策略的地理标志羊肉真实性鉴别技术。该技术突破了目前我国研究羊肉产地溯源领域传统判别手段只能针对所收集样本范围内的产地真实性鉴别的瓶颈。实现了只需要收集一类目标样品，就可以从所有欺诈样本中鉴别真实本，减少了样本和数据收集的系统工作量，在真实性鉴别领域具有更广泛的应用性能。