强化淀粉类食品中7种水溶性维生素的快速测定

牛灿杰，叶素丹，胡玉霞，王凤军，凌 云

（浙江经贸职业技术学院，浙江 杭州 310012）

随着经济水平的逐渐提升，人们对食品的需求逐渐从“吃得放心”转化为“吃得营养”[1]。营养强化淀粉类食品作为营养强化食品，如营养强化米粉，营养强化面条等发展迅速[2]，人们越来越关注其营养成分，然营养素检出不合格的情况较多[3]。水溶性VB1、VB2、VB3（烟酸、烟酰胺）、VB6（吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺）等作为重要的营养成分，对其检测具有重要意义。目前，针对水溶性维生素的国家标准检测方法多为单一维生素的检测，前处理步骤繁琐，不易操作，检测周期长。多种水溶性维生素同时检测的研究方法主要为液相色谱-串联质谱法[4-7]和液相色谱法[8-13]。液相色谱-串联质谱法仪器价格昂贵、操作难度较大、维护成本高、一般实验室难以配备。高效液相色谱法则主要采用紫外检测器进行检测，部分维生素检出限较高，干扰严重。研究的样品基质以奶粉[14-18]和保健食品[19-24]居多，且对于VB6的测定多只检测其中的一种[4-6]，而研究表明，淀粉类食品中含有吡哆醛、吡哆醇和吡哆胺形式的VB6[25]。VB1、VB2、VB3（烟酸、烟酰胺）、VB6（吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺）作为强化类食品的重要组成部分[26]，其在营养强化淀粉类食品中同时检测的方法并鲜见报道。基于此，本研究采用高效液相色谱-二极管阵列-荧光（high performance liquid chromatography with diode array detector and fluorescence detector，HPLC-DAD-FLD）联用的方法检测强化淀粉类食品中的7种水溶性维生素，对酶解条件、提取液、流动相等实验条件进行探究；通过不同时间段转化荧光检测器激发、发射波长实现VB2、吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺的同时检测，降低基质干扰、提高灵敏度，以期建立快速、准确、可同时检测强化淀粉类食品中多种维生素的检测方法，打击无良商家的非法行为，保护消费者权益，为政府监督抽查及风险监测提供技术支撑，进而促进营养强化食品行业的健康发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

强化淀粉类食品：胡萝卜营养米粉、淮山薏米营养米粉、南瓜玉米营养米粉、原味营养米粉、蛋黄双歧因子营养米粉、牛肉番茄营养米粉、小米苹果营养米粉、小米燕麦营养米粉、鸡肉蔬菜营养米粉、鱼肉DHA营养米粉、果蔬宝多维营养米粉、DHA核桃仁营养米粉、铁锌钙营养米粉、营养强化小面条、均衡营养小面条、多彩果蔬面、多彩杂粮面、营养强化核桃面、营养均衡菠菜面、牛油果菠菜营养面条，以上样品主要来源于市购。

VB1（盐酸硫胺素，纯度99.9%）、VB2（纯度98.0%）、烟酸（纯度99.8%）、烟酰胺纯度（纯度99.8%）、盐酸吡哆醇（纯度99.9%）、盐酸吡哆醛（纯度99.9%）、双盐酸吡哆醇（纯度99.9%） 北京坛墨质检科技有限公司；盐酸（分析纯） 杭州嘉辰化工有限公司；磷酸（色谱纯，85%） 济宁诚泰化工有限公司；十二烷基硫酸钠（离子对色谱纯）、淀粉酶（α-淀粉酶，生物酶活力≥1.5 U/mg） 上海麦克林试剂公司；磷酸二氢钾（分析纯） 西陇科学股份有限公司；乙腈（色谱纯） 美国Tedia公司；实验所用的水均为超纯水。

1.2 仪器与设备

UltiMate 3000 DGLC双三元高效液相色谱仪（配有DAD、FLD及变色龙Chromeleon7色谱数据处理系统）美国Thermo Fisher公司；SK6200LHC超声仪 上海科导超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制

分别准确称取VB1、VB2、烟酸、烟酰胺、盐酸吡哆醛、双盐酸吡哆胺、盐酸吡哆醇标准物质，用0.01 mol/L盐酸溶液溶解并定容，配制成标准储备液，VB1质量浓度为100 mg/L，VB2质量浓度为50 mg/L，烟酸质量浓度为500 mg/L，烟酰胺质量浓度为500 mg/L，盐酸吡哆醛质量浓度为100 mg/L，双盐酸吡哆胺质量浓度为100 mg/L，盐酸吡哆醇质量浓度为100 mg/L，再用水逐级稀释成系列混合标准工作液。

1.3.2 样品前处理

准确称取5 g样品（已经粉碎并混合均匀）于具塞锥形瓶中，加入40 mL超纯水，加入0.5 g淀粉酶，在60 ℃振荡水浴锅中，振荡酶解45 min，用盐酸溶液调pH 1.7，放置2 min后，再用氢氧化钠水溶液调pH 4.5，充分混匀后于超声仪中超声提取10 min，转移定容至100 mL容量瓶中，过0.22 μm水膜，上机。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温35 ℃；流动相：A相为十二烷基硫酸钠溶液（5 mmol/L，加入0.1%磷酸，再用三乙胺调节pH值至3.0），B相为乙腈；梯度洗脱条件：0～5.0 min，90% A，10% B；5.0～20 min，90%～38% A，10%～62% B；20.1～25.0 min，38%～90% A，62%～10% B；25.1～33.0 min，90% A，10% B。流速1 mL/min；进样量10 μL；检测器为DAD串联FLD，DAD检测波长为261、245 nm。FLD：0～10 min，激发波长462 nm，发射波长522 nm，10～28 min，激发波长293 nm，发射波长462 nm。

1.4 数据处理

采用UltiMate 3000 DGLC双三元高效液相色谱仪的变色龙Chromeleon7色谱数据处理系统及Excle软件进行图谱分析及数据处理。

2 结果与分析

2.1 检测波长的选择

取7种维生素的标准溶液分别进样，在190～800 nm波长下进行扫描，见图1。VB1、烟酸、烟酰胺分别在波长246、261 nm左右有最大吸收，因此选为检测波长；VB2在波长267、445 nm处有最大吸收，吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺在波长290 nm左右有最大吸收；采用最大吸收波长作为检测波长进行色谱条件摸索，确定各目标物质出峰时间，VB2、VB6有荧光特性，采用荧光检测代替紫外检测，既可以提高检测灵敏度降低检出限，同时可以大大减少干扰峰的影响。因此，根据VB2、VB6的荧光特性，在VB2的出峰时间段采用激发波长462 nm，发射波长522 nm，在VB6的出峰时间段选用激发波长293 nm，发射波长462 nm，进行检测。

图1 7种水溶性维生素光谱图Fig. 1 Spectra of seven water-soluble vitamins

2.2 流动相的选择

目前，多种水溶性维生素同时检测，常用流动相主要为磷酸氢二钾缓冲液[13,20]、离子对试剂[10,22-24,27]。在已有实验条件下，研究发现，采用磷酸氢二钾缓冲液[13]（0.05 mol/L，pH 6.0），VB1、VB2、吡哆醇分离良好，烟酸峰出现肩峰，经光谱辅助定性为同种物质，考虑为流动相pH值的影响，吡哆醛、吡哆胺未出峰；采用磷酸氢二钾缓冲液[20]（0.05 mol/L，pH 3.0），烟酸峰形良好，即pH 3.0左右，有利于改善烟酸的峰形，吡哆醛、吡哆胺仍未出峰，考虑目标物质在色谱柱上保留较弱，宜加入离子对试剂。采用离子对试剂十二烷基硫酸钠缓冲液时[24]（5 mmol/L，含0.05%甲酸），吡哆醛出峰，但峰形不对称，吡哆胺未出峰，进一步研究发现，采用十二烷基硫酸钠（5 mmol/L，加1 mL磷酸，后再用三乙胺调节pH值至3.0），此时7种维生素得到较好分离，峰形良好，见图2，三乙胺的加入利于改善吡哆醛的峰形，同时吡哆胺出峰。对不同浓度的十二烷基硫酸钠缓冲液进行研究发现，当十二烷基硫酸钠浓度为1～4 mmol/L时，烟酸、烟酰胺、VB1的峰形会出现不同程度的拖尾，5～20 mmol/L时，7种维生素分离较好，峰形较佳。因此，在保证良好分离及较好峰形的前提下，减少离子对试剂对色谱柱的伤害，因此最终确定十二烷基硫酸钠（5 mmol/L，加1 mL磷酸，用三乙胺调节pH值至3.0）作为流动相。研究发现，乙腈作流动相比甲醇作流动相出峰更快、峰形更好，因此采用乙腈-十二烷基硫酸钠缓冲液作为流动相进行洗脱。由于7种维生素在色谱柱上保留能力相差较大，因此采用梯度洗脱，但是采用离子对试剂进行梯度洗脱时，短时间梯度快速变化，更容易出现鬼峰及台阶峰，宜适当延长改变梯度的平衡时间。

图2 7种水溶性维生素色谱图Fig. 2 Chromatograms of seven water-soluble vitamins

2.3 酶解温度的选择

强化淀粉类食品中淀粉含量较高，良好的酶解条件，既要利于目标物质的提取，又要尽可能降低目标物质的损失。在营养强化米粉样品中加入混合标准溶液，按加工工艺进行充分混匀[28]。实验研究酶解时间为45 min时，45、50、55、60、65、70 ℃酶解条件下，7种维生素的平均加标回收率（n=6）如图3所示。结果表明，酶解温度由45 ℃升至60 ℃时，7种维生素的平均加标回收率逐渐增加，增加速度逐渐减小，可能是随着温度升高，越来越接近最佳酶解温度，酶解反应越来越充分，维生素游离出来；60 ℃升至70 ℃时，维生素的加标回收率有所下降，下降速度逐渐增大，烟酸、烟酰胺的回收率高于其他几种维生素，可能是温度升高，降低了淀粉酶的催化效率，同时，可能与维生素自身的稳定性有关，在温度相对较高，近中性的水溶液中烟酸、烟酰胺相对稳定，其他维生素更易损失，综上，选择酶解温度为60 ℃。

图3 不同酶解温度测得维生素的平均加标回收率（n=6）Fig. 3 Effect of hydrolysis temperature on average recoveries of vitamins from spiked samples (n = 6)

2.4 酶解时间的选择

在营养强化米粉样品中加入混合标准溶液，按加工工艺进行充分混匀[28]，酶解温度60 ℃，考察酶解时间分别为15、30、45、60、75、90 min，测得7种维生素的平均加标回收率（n=6）如图4所示，酶解时间由15 min升至45 min时，维生素的加标回收率逐渐增加，可能是随着时间的延长，酶解反应更充分，维生素释放更充分；由45 min延长酶解时间至60 min时，几种维生素的加标回收率变化不大，酶解时间由60 min升至90 min时，VB1、VB2、吡哆醛、吡哆胺的加标回收率略微下降，兼顾提高回收率、节约时间的原则，选择酶解时间为45 min。

图4 不同酶解时间测得维生素的平均加标回收率（n=6）Fig. 4 Effect of hydrolysis time on average recoveries of vitamins from spiked samples (n = 6)

2.5 提取液的选择

结合7种维生素国标法及已有研究[6,20,24,27]，探究酶解后2种前处理方式对检测结果的影响：方式（1）10%甲醇+0.1%磷酸溶液作提取液；方式（2）先用酸调pH 1.7，静置2 min后再用碱调pH 4.5。如图5所示，以基质相对简单的原味营养强化米粉作基质时，2种前处理方式，7种水溶性维生素的测定平均值（n=6）的相对标准偏差为1.07%～5.38%，小于10%，无明显差异；两种处理方式的平均加标回收率（n=6）在92%～103%之间，就准确度而言可以满足该类实际样品检测；但对于较为复杂的样品基质，如牛肉番茄米粉、果蔬宝营养米粉、营养均衡菠菜小面样品，采用10%甲醇+0.1%磷酸溶液作提取液时，在VB1、烟酸、烟酰胺的出峰位置会有不同程度的干扰，增加了分离难度，可能是有机溶剂的加入，提取出来部分干扰物质，而采用方式（2）并没有出现干扰。因此，本实验采用先用酸调pH 1.7，静置2 min后再用碱调pH 4.5。

图5 2种提取方式测得维生素的平均加标回收率（n=6）Fig. 5 Effect of extraction methods on average recoveries of vitamins from spiked samples (n = 6)

2.6 标准曲线及检出限、定量限结果

按照1.3.1节配制的系列标准溶液，以待测组分的质量浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，以3 倍信噪比对应的目标物质量浓度为检出限，以10 倍性噪比对应的目标物质量浓度为定量限，所得7种维生素线性回归方程、相关系数、检出限、定量限见表1。

表1 7种维生素的线性关系、检出限、定量限Table 1 Linear relationships, limits of detection and limits of quantification of seven vitamins

2.7 方法回收率和重复性实验结果

按优化好的实验条件分别向营养强化米粉样品中加入标准溶液，根据实际购买样品标签上的标识，选定7种维生素的加标水平以评价方法的回收率及重复性。所得数据见表2，VB1的回收率为95.6%～100.6%，相对标准偏差为0.80%～1.25%，VB2的回收率为90.5%～97.2%，相对标准偏差为0.70%～2.50%，烟酸的回收率为95.9%～99.3%，相对标准偏差为0.48%～1.20%，烟酰胺的回收率为92.2%～98.4%，相对标准偏差为0.63%～1.49%，吡哆醛的回收率为93.5%～102.1%，相对标准偏差为1.29%～2.93%，吡哆醇的回收率为92.0%～102.5%，相对标准偏差为2.12%～3.45%，吡哆胺的回收率为91.1%～97.1%，相对标准偏差为1.86%～3.07%，该方法回收率高，精密度好，可满足强化类淀粉食品中7种维生素同时检测的要求。

表2 加标回收率和相对标准偏差（n=6）Table 2 Recoveries and RSDs for spiked samples (n = 6)

2.8 本方法与现有方法的比较

取营养强化米粉、营养强化面条各一批次样品，分别依据本实验建立方法、国标方法进行检测，重复6 次平行实验，所得数据见表3、4。就检测值看，采用本方法所得测定值与国标方法测定值，均高于标签标识值，标识值为人为添加的含量，而样品基质本身含有一定量的维生素，测定值高于标识值合理，更接近真实值；建立的方法与国标方法的测定值没有明显差异，建立的方法能够满足实际样品的测定。就检测项目和时间而言，需要采用4 个国标方法完成7种维生素的检测，前处理较为耗时，VB1、VB2水解时间均需16 h以上，不同维生素采用不同的流动相体系，完成一批次样品检测需要耗时3～4 d，采用本方法0.5 d即可完成检测，更利于大批量样品检测，以满足风险监督快速抽检的需要。

表3 本实验建立方法与国标方法测定值对比（营养强化米粉）（n=6）Table 3 Comparison between the results of the HPLC method and the national standard methods for VBs in nutrient-fortified rice flour and the certified values (n = 6) μg/100 g

表4 本实验建立方法与国标方法测定值对比（营养强化面条）（n=6）Table 4 Comparison between the results of the HPLC method and the national standard methods for VBs in nutrient-fortified noodles and the certified values (n = 6) μg/100 g

2.9 实际样品检测

结合本研究方法对20 批次产品进行检测，结果发现，根据标签明示值及GB 28050—2011《预包装食品营养标签通则》中对营养成分的判定，所检样品中维生素测得值与标签值均符合。所检样品中，有15 批次样品VB3仅以烟酰胺形式检出，3 批次以烟酸形式检出，2 批次样品同时检出少量烟酸和烟酰胺；有17 批次样品VB6的检出形式为吡哆醇，3 批次检出吡哆醛、吡哆醇，这可能与商家的添加形式、样品基质本底量有关。本实验进行检测的营养强化淀粉类食品，以主流强化米粉、面条为主，样品类型及数量比较有限，有待进一步扩大强化淀粉类食品研究范围。

3 结 论

采用HPLC-DAD-FLD联用方法同时快速检测强化淀粉类食品中VB1、VB2、烟酸、烟酰胺、吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺的方法，步骤简单，节约时间，方法回收率高，利于大批量强化淀粉类食品中水溶性维生素的快速检测，为改善现有研究中强化淀粉类食品中多种水溶性维生素同时检测方法匮乏的现状提供了基础技术参考，然本研究中以营养强化淀粉类食品中的主流产品，强化米粉、面条为研究对象，针对其他产品的研究尚欠缺，有待进一步深入研究，以促进营养强化食品行业的健康发展。