新鲜乳扇贮存期间关键香气组分变化分析

王亚东，韩颢颖，韩兆盛，王绒雪，王 姣，杨智杰，曹雁平，王 蓓

（北京工商大学食品与健康学院，北京 100048）

乳扇是我国云南地区极富特色的典型酸凝型拉伸奶酪，具有独特的外形和风味，同时还含有脂肪酸、蛋白质、维生素、钙、磷等多种营养组分，是我国一种重要的传统乳制品之一[1]。乳扇传统制作工艺是使用当地新鲜酸木瓜发酵制成酸水，原料乳在发酵液酸水作用下发生酸凝，将凝乳块在加热的酸水中进行洗涤后热烫拉伸，晾干成型后制备完成[2-3]。乳扇有多种食用方法，可生食，也可煎炸或焙烤后蘸椒盐或玫瑰糖浆食用。但目前乳扇多以手工作坊生产为主，其脂肪含量高，贮存过程中易氧化酸败，所以一般保质期为15 d左右。目前，乳扇的研究主要集中在加工技术[4-8]、不同工艺处理对其贮存期的影响[9-10]以及微生物群落多样性[11]等方面，对乳扇在贮存过程中风味化合物变化情况的研究还相对较少，因此还需要对其进行更深入的研究。

风味是决定乳制品质量的重要特征之一[12-14]。挥发性风味化合物包括脂肪酸类、酯类、醇类、醛类、酮类、内酯类、芳香及其杂环类和含硫化合物等。近年来国内已有研究者对我国传统酸凝奶酪中的挥发性风味物质开展了初步研究。宫俐莉等[15]对实验室自制奶豆腐发酵期间挥发性风味物质进行分析，研究得到奶豆腐发酵前期以脂肪酸类物质为主，发酵中期以醇类、酮类物质为主，发酵后期以酮类、芳香族类物质为主。Wang Bei等[16]对中国西北地区的传统乳制品奶疙瘩进行风味分析，研究得到酸类、呋喃类、酯类和酮类是奶疙瘩中最重要的挥发性化合物，一些芳香化合物如丁酸、高呋喃酮、己酸乙酯和丁酸乙酯在奶疙瘩的整体风味中起着最重要的作用；Tian Huaixiang等[17]通过对6种市售乳扇产品进行风味分析，确定丙酸、丁酸、辛酸、辛醛、壬醛、2-壬酮和己酸乙酯为6种市售乳扇产品的关键香气化合物。

本实验旨在确定乳扇在制作完成后贮存期间关键香气组分的变化情况。首先，使用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）测定新鲜乳扇在贮存过程中挥发性风味化合物的变化情况；其次，利用气相色谱-嗅觉（gas chromatographyolfactometry，GC-O）测量法鉴定乳扇贮存中的特征风味化合物，同时对乳扇进行描述性感官评价。最后，对乳扇的特征风味化合物进行精确定量并进行气味活性值（odor activity values，OAV）分析确定关键香气组分。对新鲜乳扇贮存过程中关键香气组分的变化分析可以为中国传统乳制品的开发和研究提供重要信息。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

制作乳扇所用发酵液采集于云南省大理市喜洲镇，原料乳采集于石家庄君乐宝乳业集团（蛋白3.35%、脂肪3.81%、乳糖4.65%）。

正构烷烃（C7～C40，色谱纯） 美国O2si公司；氦气（纯度99.999%） 北京氦普北分气体工业有限公司。

1.2 仪器与设备

7890B-5977A GC-MS联用仪、DB-WAX型毛细管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国Agilent公司；7890B-ODP3 GC-O仪 德国Gerstel公司；HH-1型超级恒温水浴锅 金坛市至翔科教仪器厂；固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）装置手柄、固定搭载装置、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头 美国Supelco公司；MX-E旋涡混匀仪 美国赛洛捷克公司。

1.3 方法

1.3.1 乳扇制作工艺

在传统乳扇制作工艺的基础上进行优化[18]。

制作流程如下：原料乳→巴氏杀菌（65 ℃，30 min）→加入1 mol/L的CaCl2并充分搅拌→原料乳冷却至50 ℃→加入酸水，凝乳60 s→将整个体系加热至70 ℃对凝乳块进行热烫拉伸→将拉伸后的凝乳块阴凉处风干→成品乳扇。阴凉通风处避光处贮存。

1.3.2 SPME-GC-MS测定

根据上述工艺条件进行乳扇的制作，分别对制作完成第1、4、7、11、15天的乳扇样品进行风味组分的检测。取6 g乳扇样品和1 μL内标（0.816 mg/mL的2-甲基-3-庚酮和0.931 mg/mL的2-甲基戊酸）放入40 mL顶空瓶中，将待吸附样品在60 ℃水浴中平衡30 min，然后将老化好的萃取头插入顶空瓶中进行萃取，吸附时间为30 min。

GC条件：DB-Wax毛细管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；氦气为载气，流速1 mL/min；升温程序：溶剂延迟4 min，起始柱温40 ℃，保持4 min，以4 ℃/min升到100 ℃，保持2 min，然后以3 ℃/min升到150 ℃，最后以5 ℃/min升到230 ℃，保持2 min。采用不分流模式，进样口温度250 ℃。

MS条件：电子电离源；电离能量70 eV；离子源温度230 ℃；接口温度250 ℃；四极杆温度150 ℃；检测器温度250 ℃；扫描模式为全扫描；质量扫描范围m/z20～350。

1.3.3 定性定量分析

定性分析：采用3种方法对化合物定性：首先在NIST 14谱库中进行检索对比；其次，计算化合物的保留指数（retention index，RI）并与文献中的RI进行对比；最后，比对嗅闻结果。将正构烷烃C7～C40与在相同的色谱条件下得出GC保留时间按下式计算待测物i的RI（tn＜ti＜tn+1）：

式中：n为碳原子数；t为样品i的保留时间/min；tn为碳原子数为n的正构烷烃保留时间/min；tn+1为碳原子数为n+1的正构烷烃保留时间/min。

定量分析：对所有风味化合物的定量方法采用内标半定量的方式，根据化合物及内标化合物峰面积比值计算各挥发性成分的含量；对嗅闻得到的特征风味化合物进行内标法（2-甲基-3-庚酮）精确定量。

1.3.4 GC-O测定

对样品进行GC-O分析。嗅闻实验由5 名接受过嗅闻训练的评价人员完成。GC-O条件：嗅探口接口温度200 ℃，在检测口通入湿润的空气以防止评价人员的鼻腔干燥、导致嗅觉疲劳。嗅闻方法：同一样品进样4 次，每次由2 名评价员分前两后段轮流嗅闻并在嗅探口记录下香气时间、香气描述特征，一个样品共需要4 名评价员，3 个以上评价员的描述一致时方可确定风味化合物[19]。

1.3.5 感官评价

选择12 名（8 女4 男，平均年龄24 岁）经过专业感官评价培训且具有一年以上乳制品感官评价经验的评价员成立感官专家评价小组，对不同贮存时间的乳扇进行描述性感官评价。评价采用5 分标度法（0，不存在；1，非常轻微；2，轻微；3，中等；4，显著；5，非常显著）。感官风味描述如表1所示。

表1 乳扇风味感官描述词Table 1 Sensory descriptors of milk fan flavor

1.4 数据处理

嗅闻实验进行4 次重复，其余实验均重复进行3 次，实验结果用表示。所有图表均以d1、d4、d7、d11、d15表示贮存的第1、4、7、11、15天。挥发性化合物主成分分析采用SIMCA 14.0、Origin 2018及IBM SPSS Statistics 23进行分析。

2 结果与分析

2.1 乳扇在贮存过程中风味化合物的变化分析

表2 乳扇在贮存过程中风味化合物含量的变化Table 2 Changes in contents of flavor compounds in milk fan during storage

续表2

图1 乳扇在贮存过程中风味化合物含量的变化Fig. 1 Changes in contents of flavor compounds in milk fan during storage

采用SPME-GC-MS对乳扇后发酵阶段的风味化合物进行分析，共鉴定出70种挥发性风味化合物，其中，脂肪酸类16种、酯类11种、芳香及杂环类11种、醛类9种、醇类8种、酮类8种、内酯类5种、含硫类2种（表2、图1）。随着贮存时间延长，风味化合物种类无明显差别，除醛类化合物外其余化合物的含量均逐渐降低，这可能与乳扇传统开放式的晾晒式贮存方式有关。

脂肪酸类化合物在奶酪的风味形成中发挥着非常重要的作用，它不仅是奶酪中主要的风味物质，也是酯类、醛类和甲基酮类等其他风味物质的前体物质。乳扇在制作后第1天的脂肪酸类化合物含量最高，为8 144.51 μg/kg。其中含量最高的脂肪酸类化合物为丁酸和乙酸，分别为2 535.86 μg/kg和1 713.08 μg/kg。丁酸是乳扇当中特殊奶臭味的来源，也是大部分奶酪的特征风味组分[20]。其余挥发性较强的中、短碳链脂肪酸如己酸、辛酸、癸酸的含量也很高，在乳扇中含量均为1 000 μg/kg左右，这些中、短碳链的脂肪酸类化合物阈值较低[21]，在含量较高的情况下会产生特殊的奶臭味、酸败等刺激味道，因此其含量对奶酪风味品质具有重要影响。

酯类是奶酪中常见的挥发性化合物，尤其是一些含有中短链脂肪酸的乙酯[22]，通常能产生令人愉悦的气味，是奶酪中的特征风味组分。乳扇在制作完成第1天酯类含量最高（1 475.96 μg/kg），随着贮存时间延长，酯类总含量减少，且逐渐趋于稳定。其中，丁酸乙酯、乙酸丁酯、己酸乙酯和癸酸乙酯这些常见的中、短碳链脂肪酸乙酯在乳扇中的阈值较低，这类酯类物质的混合物被称为黄油酯[23]，通常能产生令人愉悦的气味。这几种酯类化合物中含量最高的为辛酸乙酯，具有白兰地酒的香气且有甜味，而丁酸乙酯、乙酸丁酯和己酸乙酯都具有奶香味、果香味以及奶油味。

芳香及杂环类化合物一般由美拉德反应生成，在乳扇制作后的第1天总含量最高，为584.89 μg/kg，之后有所下降并稳定在130 μg/kg左右。其中，甲苯在乳扇中含量较高，在第1天的最高值为133.02 μg/kg，它能赋予乳扇坚果味、杏仁味。乳扇中还检测出少量萜类化合物（柠檬烯）和呋喃类化合物，柠檬烯能产生类似于柑橘的酸甜气味，主要来自于饲料牧草。而呋喃类化合物是奶酪中焦糖味特征香气的主要来源，与乳扇热烫拉伸过程中美拉德反应相关性较大。

醇类化合物是奶酪中比较普遍存在的一种风味物质，它的来源主要有以下4种：乳糖代谢、甲基酮还原、氨基酸代谢和亚油酸、亚麻酸降解[24]。乳扇中的醇类化合物在制作后的第1天含量最高，为181.62 μg/kg，之后有所降低且逐渐趋于平稳。在奶酪成熟过程中醇类物质会与酸发生反应，因而奶酪的成熟时间越长，醇类物质含量越少[25]。含量较高的醇类化合物有正丁醇和苯乙醇，含量分别为49.55 μg/kg和49.18 μg/kg，正丁醇具有特殊的酒香味，而苯乙醇具有玫瑰花香味，它们都赋予乳扇特殊的气味。

奶酪中醛类化合物主要来源于脂肪酸代谢、氨基酸转氨作用或Strecker降解[26]。醛类物质性质较为活泼，对于乳制品的新鲜度和花香风味有很大的贡献。随着发酵时间的延长，醛类物质的总含量呈上升趋势，在乳扇制作后的第11天检测到7种醛类化合物，且总含量最高，为332.46 μg/kg，其中，壬醛、正己醛和庚醛的含量较高，分别为147.47、65.39、42.66 μg/kg，且乳扇中的醛类化合物也以这几种直链醛类为主，它们的阈值都较低，其中，己醛具有青草的香气，庚醛具有青味和腊味，壬醛具柑橘的香气，它们能很好地修饰乳扇的风味，随着贮存时间延长，醛类化合物含量略有升高，可能跟乳扇中脂肪随着放置时间延长逐渐氧化有关。

酮类化合物是奶酪中重要的风味组分，其中，甲基酮类化合物对奶酪的风味组成发挥着重要作用，它们一般由不饱和脂肪酸氧化产生[27]。酮类化合物在乳扇制作后的第1天含量最高，为230.69 μg/kg，之后有所降低，保持在150 μg/kg左右。乳扇中含量较高的甲基酮有2-庚酮和2壬酮，且2-壬酮在第1天含量最高，为128.46 μg/kg。此外，乳扇中还检测出了3-羟基-2-丁酮，它和甲基酮类化合物都能产生令人愉悦的奶油香气[28]，可以修饰乳扇的风味，且阈值都较低，能明显提高乳扇的感官品质。

内酯类化合物是游离脂肪酸的代谢产物[29]。在乳扇制作过程中产生较少，在制作之后第1天含量开始增加，并保持在100 μg/kg左右。其中，γ-丁内酯、δ-癸内酯和δ-十二内酯在各阶段都检出，且δ-癸内酯在15 d的含量均较高。乳扇中的内酯类化合物种类不多，含量也相对较低，但它们的阈值相对较小，且一般具有奶油味、坚果味、花香味等良好的风味，能使奶酪的风味更加饱满醇厚，显著提升乳扇的感官品质。

含硫化合物在乳扇制作后的发酵过程中均能检测到，且含量保持在25 μg/kg左右。含硫化合物是奶酪成熟期间的重要风味组分，主要来源于乳蛋白中甲硫氨酸的降解[29]。在乳扇后发酵期间，二甲基砜各阶段都能被检测到，它对奶酪整体香气轮廓形成可能具有重要作用。

综上所述，通过SPME-GC-MS对乳扇在制作过程及后发酵阶段所产生的风味物质进行检测，共检测出70种挥发性风味组分。含量及种类最多的是脂肪酸类化合物，其次为酯类、芳香杂环类、醛类、醇类等化合物。其中，酯类、醇类、酮类这些能产生花香、果香等良好风味的化合物在乳扇制作后第1天含量最高，分别为1 475.96、181.62、230.69 μg/kg，而脂肪酸类化合物与其他奶酪相比含量适中，为8 144.51 μg/kg。

2.2 乳扇贮存过程中特征香气的精确定量

由于化合物对样品的风味贡献程度不仅取决于化合物含量的高低，还与其对应的阈值有关[30]，为了更好地对新鲜乳扇风味组分的贡献情况进行评定，本研究结合文献阈值结果对嗅闻得到的19种特征风味化合物进行精确定量和OAV分析。对乳扇中嗅闻得到19种特征风味化合物的定量结果如表3所示。根据标准曲线及校准因子f计算这些特征风味组分在乳扇中的准确含量变化。由表3可以看出，脂肪酸类化合物在乳扇中的种类及含量均最高[30]，其中含量最多的脂肪酸类化合物为丁酸，含量变化范围为2 280.59～3 271.26 μg/kg，丁酸具有典型奶臭味，是乳扇中重要的风味物质。乳扇中含有多种酯类化合物，虽然含量不高，但由于其有较低阈值，且风味良好，因此是乳扇风味构成的重要成分，乳扇中的酯类化合物的含量变化范围在未检出～93.41 μg/kg，其中含量最高的酯类化合物为辛酸乙酯，含量变化范围在26.28～93.41 μg/kg，它具有奶油的香气，能为乳扇提供醇厚的风味及口感[31-32]。乳扇中的特征醇类物质有苯乙醇和正丁醇，其含量变化范围为66.39～98.27 μg/kg，它们在乳扇的风味形成中提供了花香、酒香等优良风味。醛类化合物含量的变化范围为未检出～133.95 μg/kg，在发酵后期的变化较为稳定，它们在低含量范围内能为乳扇提供青草等清新的香味。乳扇中的酮类化合物为2-庚酮和2-壬酮这2种甲基酮，它们的含量均不高，在8.36～73.22 μg/kg范围内，但因其阈值较低，因此也能产生较为浓烈的花果香味，能很好地修饰乳扇中脂肪酸类化合物产生的酸味。内酯类化合物含量变化范围为9.33～96.60 μg/kg，其中，δ-癸内酯含量最高，它具有奶油味和甜味，是乳扇中良好乳脂香气的一个重要来源。

表3 19种嗅闻得到的风味化合物的标准曲线和含量Table 3 Standard curves and concentrations of 19 aroma compounds identified by GC-O

2.3 乳扇贮存过程中特征风味化合物的OAV分析

表4 19种特征风味化合物OAV结果Table 4 OAVs of 19 characteristic flavor compounds

如表4所示，有16种化合物的OAV大于1，包括酯类5种、脂肪酸类5种、醇类2种、醛类2种、内酯类2种。它们对新鲜乳扇的风味有较大贡献度，是其关键香气组分。其中己酸乙酯的OAV最大（71.39），其次是乙酸丁酯（59.42）和丁酸乙酯（45.22），它们具有奶香味、果香味以及奶油味。5种关键酯类化合物的OAV随着贮存时间的延长呈现降低趋势。OAV大于1的酸类有乙酸、丁酸、己酸、辛酸和癸酸，这几种挥发性较强的中、短碳链脂肪酸，通常会赋予乳制品令人不太愉悦的刺激味、奶臭味等，5种关键酸类化合物的OAV随贮存时间的延长无明显变化。OAV大于1的醇类化合物有正丁醇和苯乙醇，正丁醇具有特殊的酒香味，而苯乙醇具有玫瑰花香味，它们都赋予乳扇特殊的气味。两种关键醇类化合物的OAV随着贮存时间的延长无明显变化。OAV大于1的醛类有壬醛、己醛。其中，己醛具有青草的香气，壬醛具有柑橘的香气。2种关键醛类化合物的OAV随贮存时间的延长呈现轻微上升。乳扇中的内酯类化合物种类较少，OAV大于1的内酯有γ-丁内酯和δ-癸内酯，一般具有奶油味、坚果味、花香味等良好的风味。2种关键内酯类化合物的OAV随着贮存时间的延长无明显变化。

2.4 乳扇的感官评价

图2 乳扇感官评价风味图Fig. 2 Radar maps of sensory evaluation of milk fan flavor

由图2可知，就乳扇气味而言，乳扇的总体气味较为温和。在贮存的前7 d，乳扇中的果香味、酸味和奶香味是乳扇最显著的气味特征。果香味与酯类化合物有关，酯类化合物的OAV随着贮存时间的延长逐渐降低，乳扇的果香味也在逐渐减弱，果香味评分从第1天的3.8降低到第15天的2.5。酸味（气味）与乳扇的脂肪酸类化合物有关，主要来源于乙酸、丁酸、己酸、辛酸和癸酸等，与酸类化合物的OAV变化趋势相同，乳扇的酸性气味特征也无明显变化。奶香味主要和酮类化合物相关，随着贮存时间的延长，酮类化合物的OAV逐渐降低，乳扇的奶香味呈现减弱的趋势。乳扇的酒香味和奶臭味相对强度较低，并且随着贮存时间的延长无明显变化。

就乳扇滋味而言，鲜味、咸味、苦味和甜味变化不大，酸味变化相对较大，随着贮存时间的延长，酸味逐渐增强，推测可能由于乳扇中乳酸和肽类（γ-谷氨酰胺二肽、天冬氨酸和组氨酸等）组分含量变化有关[34]，还需要进一步的实验探究其具体原因。贮存第1天的乳扇甜味和鲜味评分最高，咸味、苦味和酸味的评分最低。随着贮存时间延长，乳扇的滋味感官品质呈降低趋势。综合乳扇样品气味和滋味感官评分结果，乳扇制作完成的第1天气味和滋味感官品质最佳，随着贮存时间的延长，乳扇的风味品质逐渐降低。

2.5 乳扇关键香气组分、感官性质和贮存时间的相关性分析

为了进一步解析乳扇的关键香气组分在贮存过程中的变化情况，将乳扇的感官性质、关键香气组分以及贮存时间进行了偏最小二乘分析。如图3所示，乳扇的贮存期可分为3 个阶段。第1阶段为乳扇贮存的第1天，此时的乳扇甜味、鲜味、果香味和奶香味明显，这主要是由于第一天的乳扇乙酸乙酯、己酸乙酯等酯类，γ-丁内酯等内酯类组分的含量最高有关。此外此时乳扇中的丁酸、癸酸等脂肪酸含量相对较高，但和成熟期较长的切达奶酪等西方奶酪相比仍较少，所以其酸味和奶臭味感官特征并不强烈；第2阶段为乳扇贮存的第4、7天，乳扇具有一定酒香品质，酒香味主要与丁酸乙酯等酒香味相关的酯类组分的含量变化存在一定相关性；第3阶段为乳扇贮存的第11、15天，这时的乳扇感官品质开始变差，突出的感官特征为酸味（气味和滋味）、咸味和苦味，出现此类现象的原因可能是乳扇中大多数关键香气组分的含量在贮存过程中逐渐降低。

图3 乳扇贮存时间、关键香气组分以及感官性质的偏最小二乘分析Fig. 3 Partial least squares analysis of storage time, key aroma components and sensory properties of milk fan

3 结 论

通过SPME-GC-MS和GC-O对乳扇贮存第1、4、7、11、15天的风味化合物进行分析，结果共鉴定得到70种挥发性风味化合物，脂肪酸类16种、酯类11种、芳香及杂环类11种、醛类9种、醇类8种、酮类8种、内酯类5种以及含硫类2种。其中嗅闻确定的化合物有19种，将这19种特征风味化合物进行精确定量和OAV分析，确定16种新鲜乳扇的关键香气组分：丁酸乙酯、乙酸丁酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸、γ-丁内酯、δ-癸内酯、正丁醇、苯乙醇、己醛和壬醛。通过偏最小二乘分析可以得到乳扇贮存的3 个阶段：第1阶段为乳扇贮存的第1天，此时乳扇感官品质最高，这与乙酸乙酯、己酸乙酯等酯类组分的含量较高有关；第2类为乳扇贮存的第4、7天，乳扇感官品质温和，具有酒香特征，这可能与丁酸乙酯的含量有关；第3类为乳扇贮存的第11、15天，乳扇的感官品质最差，仅有δ-癸内酯含量未随着贮存时间的变化而降低，其余酯类和内酯类组分的含量均随着贮存时间的延长而降低。本研究丰富了乳扇的信息，为我国传统酸凝奶酪的研究提供了一定的理论依据。