黏质沙雷氏菌磷脂酶A1辅助蛋白PlaS对宿主菌细胞膜的影响及亚细胞定位

周 杰，吴政浩，李 闯，刘庆涛，张会敏，王 洲，刘 艳，薛正莲

（安徽工程大学生物与食品工程学院，安徽省工业微生物分子育种工程实验室，微生物发酵安徽省工程研究中心，安徽 芜湖 241000）

磷脂酶A1（EC3.1.1.3，PlaA1）是一类酰基水解酶，可催化sn-1位磷脂水解成游离脂肪酸和溶血磷脂，广泛应用在粮油精制、化妆品加工等行业[1-2]。PlaA1在诸多动植物、微生物中皆有发现，如牛大脑与睾丸、大鼠肝脏、黄蜂毒液、拟南芥、沙雷氏菌、链霉菌等[3-7]。相较于其他磷脂酶，PlaA1的生理功能在很大程度上仍待探索。已经探明PlaA1的生理功能有：参与膜蛋白合成与修复、产生溶血磷脂酸及胞内信号传导、增强细菌侵袭和黏附性等[8-12]。

目前关于PlaA1的研究方向有：异源表达、分子改造及发酵条件优化等[12-13]。有学者在大肠杆菌中表达来自沙雷氏菌磷脂酶A1基因（plaA1）时发现，plaA1基因下游还有一段开放阅读框，与plaA1有8 bp重叠，与调控磷脂酶A1表达有关，被命名为磷脂酶A1辅助蛋白基因plaS[14-15]。课题组前期研究已经验证，PlaS蛋白没有磷脂酶活性，但有调控磷脂酶A1作用。在大肠杆菌中，无论是PlaA1与PlaS共表达，还是PlaS单独表达都表现出抑制宿主生长，而单独表达PlaA1时会产生大量无酶活性的包涵体且不表现抑制，这表明PlaS可调控磷脂酶A1胞外表达[16]。通过对黏质沙雷氏菌磷脂酶A1辅助蛋白S（GenBank，Protein-ID：AFN44705.1）的进一步研究发现，PlaS属于Ankyrin锚定蛋白家族中的ANK蛋白[17]。一般Ankyrin由若干个（2 个以上）蛋白重复序列（ANK repeat）串联堆叠，以形成不同的弯曲程度，从而决定成熟锚蛋白的众多生理功能[18-20]。锚蛋白的功能繁多，如调控细胞信号转导、调节转录和细胞周期及参与各种转运现象等[18,21-23]，它们通常在介导特定的蛋白质相互作用中发挥作用[24]。因此，研究PlaS有助于Ankyrin的改造与应用。

已有学者关注到PlaA1对宿主细胞的毒害作用[25-26]，但目前国内外对磷脂酶A1辅助蛋白抑制宿主生长现象的报道屈指可数。在大肠杆菌异源表达PlaS过程中，仅可通过Western blot检测其极低产量，但又表现出明显抑制作用，因而研究PlaS在表达过程中对宿主的影响有重要价值。朱昊等[27]和甘玉飞[28]先后利用N端截短技术分别截除PlaS的N端前35 个和前27 个氨基酸，发现截短后对宿主细胞生长抑制作用消失，初步探索PlaS抑制作用的关键区域为前27 个氨基酸。因此，PlaS是一种具有锚蛋白重复结构的疏水性辅助蛋白，可以增强磷脂酶A1表达与活性，同时也抑制宿主大肠杆菌生长。研究人员通过抗菌实验发现，疏水性抗菌肽与细菌细胞膜有强亲和作用[29]。细菌细胞膜的磷脂双分子层与蛋白质构成的富有弹性的半透性薄膜，参与细胞信息传递、物质传输、能量传导等过程，是细胞进行正常生理活动的重要参照。细胞膜具有动态的通透性和流动性等，而抗菌物质常通过改变细胞膜性能以破坏其完整性[30-31]。磷脂作为细胞膜的主要成分，其含量的变化也会影响细胞膜的状态[32]。蛋白质与细胞膜间的亲和作用常用亚细胞定位结果指示。通过生物信息学亚细胞定位预测显示Ankyrin锚蛋白倾向于定位在革兰氏阴性菌细胞膜上，PlaS可能与原核细胞中细胞膜上的脂质或蛋白质分子相互作用。课题组前期通过生物信息学预测与融合荧光报告基因示踪法确定BsnMenA蛋白是一种在大肠杆菌中定位于细胞膜上的膜蛋白[33]，这为研究PlaS是否为膜蛋白提供基础。然而，目前没有明确的实验证据表明PlaS是膜蛋白，对宿主膜性能有明确破坏作用。由于PlaS表达量极低，所以在探究异源表达PlaS对宿主细胞膜的影响时，需要在相同培养条件下取同等生长状态、相同体积的菌悬液以作观察。

本研究旨在通过检测生长曲线观察和显示重组大肠杆菌生长抑制现象，采取一系列实验考察PlaS表达后宿主大肠杆菌细胞膜性能、脂肪酸种类及组分的变化，并通过激光共聚焦显微实验验证PlaS的亚细胞定位，为阐明PlaS抑制宿主生长的机制提供必要的数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株与质粒

大肠杆菌BL21（DE3）、质粒载体pET28a（+）以及含有增强型绿色荧光基因egfp的pUC19质粒均为实验室保存。P28菌是将pET28a（+）空载导入大肠杆菌BL21（DE3）中；SP28菌是插入plaS到质粒载体上构建的工程菌；dSP28是将plaS基因截除N端前27 个氨基酸序列后的截短基因pladS插入到pET28a（+）上构建的菌株；SeP28与eSP28以及MeP28和eMP28菌株是分别将egfp与plaS基因、egfp与膜蛋白BsnMenA基因menA分别按照先后顺序载于pET28a（+）上，表达于大肠杆菌BL21（DE3）的菌株；eP28是egfp基因在大肠杆菌中表达的荧光对照菌；以上菌株由实验室保藏，菌株构成如表1所示。

表1 各菌株构成说明Table 1 Description of structure of all strains used in this study

1.1.2 培养基与试剂

LB肉汤、磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.4） 生工生物工程（上海）股份有限公司。

卡那霉素（Kan）溶液：取5.00g Kan以无菌水定容至100 mL；异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）溶液：取1.19 g IPTG以无菌水定容至50 mL，再通过0.22 μm滤膜过滤，使用注射器分装（1 mL/份），－20 ℃保存备用；1,6-二苯基-1,3,5-己三烯（1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene，DPH）溶液：将DPH溶于四氢呋喃中，配制2 mmol/L DPH母液；N-苯基-1-萘胺（N-phenyl-1-naphthylamine，NPN）溶液：称取0.054 8 g NPN溶于250 mL PBS中，得1 mmol/L NPN溶液，临时贮存于棕色瓶中；邻硝基苯-β-D-半乳糖苷（o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG）溶液：取0.05 g ONPG以超纯水定容至50 mL，浓度为1.5 mmol/L。以上试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

T100-聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国Bio-Rad公司；TU-1810紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；960MC-PC荧光分光光度计 上海三科仪器有限公司；2010型气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用仪 日本岛津公司；FV-1200激光共聚焦微镜 日本奥林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 生长曲线的确定

从LB平板中挑出单个菌株，转移至LB肉汤中培养至对数生长期。调节OD600nm为0.2时再以2%接种量转移至含有Kan的新LB肉汤中培养。OD600nm约为0.6时加入适量IPTG诱导剂。在整个过程中，每隔2 h取样测定OD600nm，以P28菌株为对照，培养条件为37 ℃、200 r/min。

1.3.2 细胞外膜通透性测定

用0.85% NaCl溶液冲洗具有不同诱导时间（0、4、8、12 h）的菌体沉淀，并重新悬浮使OD600nm为0.4左右。在黑暗中取1 mL细菌悬液和20 μL 1 mmol/L NPN溶液在石英比色管中快速振荡混合，立刻测定荧光强度的变化，直到强度不再变化为止。激发和发射波长分别为350 nm和429 nm。以0.85% NaCl溶液为对照。

1.3.3 细胞内膜通透性测定

以ONPG为底物，通过测定从大肠杆菌释放的胞质β-半乳糖苷酶活性确定细胞内膜通透性。将1.5 mmol/L ONPG溶液加入到稀释为OD600nm=0.4的细菌悬液中，将混合物在37 ℃下静置培养30 min，测定OD405nm，以ONPG溶液为对照。

1.3.4 细胞膜流动性测定

收集不同诱导时间（0、4、8、12 h）各个菌株，用PBS冲洗，重悬使OD600nm为0.3～0.4之间。加入适量2×10－3mmol/L DPH溶液，在暗室静置30 min后测定荧光强度。激发波长为362 nm，发射波长为454 nm。

1.3.5 细胞表面疏水性测定

采用二甲苯吸附法测定，疏水性强的细菌倾向于附着在二甲苯有机相表面，逐渐上移并悬浮在有机相中[34]。用pH 7.0 PBS洗涤不同诱导时间的细菌数次并重悬，使OD600nm为0.6，记为A0。通过在试管中剧烈摇动，将2 mL悬浮液与800 μL二甲苯混合。室温下静置，直到细菌悬浮液完全分层，仔细吸取下层相，测定OD600nm，记为A1。以二甲苯吸附后残留细菌占比表示细胞表面疏水性，按下式计算：

1.3.6 细胞膜中脂肪酸组成变化的测定

1.3.6.1 样品前处理

取不同诱导时间的各菌悬液6 mL，4 000 r/min离心1 min，弃去上清液。加入1 mL皂化反应液（9.0 g NaOH、30.0 mL甲醇、30.0 mL去离子水），混匀，100 ℃加热30 min，结束后立即冰上冷却。然后，加入2 mL甲基化反应溶液（65.0 mL 37%浓盐酸、55.0 mL甲醇），加热至80 ℃维持10 min。热处理后立即冰浴冷却10 min，加入1.25 mL反应混合物（含正己烷和甲基叔丁基醚，V/V，1∶1），剧烈摇晃后静置，直至溶液出现明显分层。取上层油状有机相。再加入3 mL 0.3 mol/L NaOH溶液，混合后静置等待分层。再将上层溶液的2/3转移至标准瓶中，保存在－80 ℃下备用。

1.3.6.2 GC条件

TG-5毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：初始温度55 ℃，保持1 min；以10 ℃/min升温至205 ℃；以5 ℃/min升温至250 ℃；以10 ℃/min升温至280 ℃，保持9 min。载气流速2.0 mL/min；进样口温度220 ℃；进样量1 μL；分流比5∶1；溶剂润洗次数（前）：3；溶剂润洗次数（后）：5；样品润洗次数：3。

1.3.6.3 MS条件

电子能量70 eV；电子电离源；离子源温度250 ℃；四极杆温度150 ℃；界面温度：280 ℃；质量扫描范围m/z29～450。

1.3.7 激光共聚焦显微镜荧光观察

将重组菌SeP28和eSP28、空载阳性对照eP28、阴性对照P28和膜蛋白阳性对照MeP28和eMP28分别接种于50 mL新鲜LB肉汤中（Kan+），37 ℃、180 r/min过夜活化，转移至50 mL新鲜肉汤中。监测OD600nm约为0.5时，加入0.1 mmol/L IPTG，在26 ℃、100 r/min下培养。为防止荧光蛋白在原核细菌中表达过量，导致荧光充盈整个视野，失去亚细胞定位能力，本研究从诱导表达开始每隔5 min取样一次，每次取菌液1 mL，在高速低温离心机中4 800 r/min离心3 min，冲洗并稀释至适当倍数，滴加到激光共聚焦小皿中央凹板上，用激光共聚焦显微镜于488 nm波长下收集荧光信息，观察重组菌中的荧光位置。

2 结果与分析

2.1 菌株生长曲线分析

为显示表达PlaS蛋白的菌株生长抑制现象，比较各菌株的生长曲线。如图1所示，诱导前各菌株生长状态趋于一致。培养3.5 h时加入IPTG，诱导表达后，各菌株生长状态开始分化。其中，P28、大肠杆菌BL21（DE3）与eP28菌株生长状态一致，培养8 h前结束对数生长期且菌体浓度无明显差异。而SP28菌株生长缓慢，培养7.5 h时OD600nm仅为1.104，10 h后已进入衰亡状态；荧光重组菌eSP28与SeP28菌株生长曲线与SP28差异不明显。相反，dSP28菌株保持指数生长，培养12 h后逐渐进入平稳期。结果表明，PlaS确实会导致宿主生长缓慢，宿主菌生长在诱导PlaS蛋白表达后受到抑制，而其N端前27 个氨基酸序列是PlaS抑制宿主生长的关键因素。

另外，dSP28菌株不仅解除了抑制，而且显示出更稳定的指数增长，对数生长期可至少延长2 h，这可能与dSP28蛋白的理化性质有关。早期研究表明，PlaS属于ANK repeat，其功能包括细胞信号转导、维持细胞骨架的完整性以及调节细胞周期、炎症反应、发育和各种运输效应[18]。截短前27 个氨基酸的dSP28蛋白可能高度表达锚蛋白的一些功能，例如维持细胞完整性、促进细胞发育和调节细胞周期，这可能是dSP28保持高速增长并且持续更长时间的原因。

2.2 菌株细胞外膜通透性分析

NPN是一种疏水性荧光染料，在细菌内外膜间异常疏水的环境中，容易被特定波长激发产生强烈的荧光，可以指示外膜的损伤[35]。如图2A所示，细菌的细胞外膜通透性整体随诱导时间的增加呈增加趋势。其中，dSP28和P28的细胞外膜变化趋势基本一致，为逐渐增加；而SP28的细胞外膜通透性在诱导8 h达到最高，比对照P28提高了49.46%，但诱导12 h时，其荧光强度明显下降，且显著低于dSP28和P28。对比生长曲线可以看出，这一现象与菌株的衰退阶段有关。当细菌处于衰退阶段时，细胞外膜逐渐分解并消失，从而失去内外膜之间的疏水环境，导致NPN无法激发显著的荧光[32,35]。因此，plaS基因的表达可以增加细胞外膜通透性，甚至表现为细胞外膜分解消失，诱发宿主死亡。

图2 各菌株细胞膜特性变化Fig. 2 Changes in cell membrane properties of all strains

2.3 菌株细胞内膜通透性分析

细菌经诱导后会在质膜上产生β-半乳糖苷酶，可将乳糖类似物分解为半乳糖和黄色邻硝基酚，因此β-半乳糖苷酶的活性可通过黄色确定[36]。如图2B所示，随着诱导时间的延长，3 个菌株的细胞内膜通透性均增加；dSP28和P28差异不显著；SP28的细胞内膜通透性随着诱导时间延长显著增加（P＜0.05），在诱导12 h时比P28内膜通透性高41.14%，这可能是因为PlaS的表达对细胞内膜的影响导致细胞膜失去选择透过性，SP28细胞失去稳态而死亡。

2.4 菌株细胞膜流动性分析

DPH是一种疏水性荧光物质，易于检测和研究膜的流动性；能穿透磷脂双分子层，与非极性尾区结合，发出强荧光，而不破坏膜结构。细胞膜流动性的严重下降是细菌细胞功能丧失的原因之一[37]。从图2C可以看出，P28和dSP28的荧光强度随诱导时间的延长先降低后升高，表明细胞膜流动性先升高后降低。SP28的细胞膜流动性在诱导8 h降低，诱导12 h显著降低（P＜0.05）。细胞膜流动性的缺失是其结构异常的表现，结构破损甚至毁坏会使宿主菌细胞功能紊乱、缺乏稳态，进而导致细胞死亡。

2.5 菌株细胞表面疏水性分析

细胞表面疏水性是决定细菌对各种生物和非生物表面和界面非特异性黏附的因素之一，一般来说，细菌表面疏水性在与抗菌物质作用后会发生变化[38]。在阳离子抗菌肽的作用下，疏水性会降低，这也是细菌死亡的原因之一[31]。如图2D所示，dSP28和P28的性能相对较为稳定；而SP28的表明疏水性在诱导4 h后显著降低（P＜0.05），诱导12 h时比P28降低了45.33%，表明此时细胞膜已被破坏。需要注意的是，SP28在诱导4 h时表现出较高的表面疏水性，这可能与PlaS蛋白的疏水性有关，但同时也损伤了细菌，所以导致诱导4 h后疏水性下降。

2.6 PlaS对细胞膜脂肪酸的影响

细胞膜主要由脂质和蛋白质组成，膜脂成分的变化会影响其流动性。GC-MS鉴定了细胞膜脂肪酸种类与含量的变化。如图3、4所示，鉴定出7种含量显著的脂肪酸，可分为直链饱和脂肪酸、支链饱和脂肪酸、顺式单不饱和脂肪酸、反式单不饱和脂肪酸和环丙烷脂肪酸。其中，直链饱和脂肪酸和反式单不饱和脂肪酸的含量与细胞膜刚性呈正相关，而支链饱和脂肪酸与顺式单不饱和脂肪酸则会提高细胞膜流动性[32,39]。有证据表明，环丙烷脂肪酸与维持细胞膜稳定性有关[40]。

图3 各菌株细胞膜主要脂肪酸含量的变化Fig. 3 Changes in the contents of major fatty acids in the cell membrane of all strains

图4 各菌株细胞膜脂肪酸鉴定分类与含量变化Fig. 4 Changes in contents of cell membrane fatty acids in all strains

从图3、4可以看出，对照组P28中所有种类的脂肪酸在诱导期间较为稳定。表现生长抑制的SP28中顺式单不饱和脂肪酸的相对含量诱导8 h时为20.19%，比诱导4 h后降低了8.38%；而诱导时间相同时，对照P28中顺式单不饱和脂肪酸的相对含量为30.34%，比SP28高10.15%。诱导8 h时，SP28直链饱和脂肪酸和反式单不饱和脂肪酸的相对含量分别为49.26%和15.13%，比4 h时分别增加9.62%和3.83%，相同诱导时间下比P28分别增加11.55%和5.31%。这些变化主要是由于SP28中10-十九碳烯酸含量的减少以及肉豆蔻酸、棕榈酸、十八烷酸和反式-9-十八碳烯酸含量的增加。

上述结果表明，PlaS在表达后会引起细胞膜脂肪酸种类及含量变化，导致细胞膜刚性增加，主要因为直链饱和脂肪酸和反式单不饱和脂肪酸的相对含量提高以及顺式单不饱和脂肪酸的相对含量降低、流动性降低、形态发生变化、细胞易死亡。值得注意的是，由图3可知，在诱导期间，dSP28细胞膜脂肪酸中棕榈酸的相对含量从30.98%下降到25.43%，而10-十九碳烯酸的相对含量从25.15%上升到33.44%。这表明dSP28没有显示出生长抑制，这也与生长曲线显示的结果一致。

2.7 菌株细胞荧光成像分析

对SeP28、eSP28、eP28、MeP28、eMP28以及P28进行荧光成像分析。前期研究显示，SeP28和eSP28可以顺利表达，但表达量极低，仅由Western blot实验测得有微量产物。由图5可知，诱导表达时间为15 min的同组样品中，膜蛋白表达菌株MeP28、eMP28在细胞膜上显示出明显的绿色荧光成像；荧光实验菌株SeP28和eSP28与膜蛋白阳性对照菌株荧光成像一致，都在细胞膜上出现绿色荧光；而阳性空载对照eP28中荧光分布于整个细胞，阴性对照P28的整个视野未有可见荧光，证明PlaS定位于大肠杆菌细胞膜上。同时荧光成像显示出SeP28和eSP28细胞表面瘦瘪甚至破裂，不及MeP28和eMP28完整、饱满，因而也具有抑制作用，结果与生长曲线相对应。对诱导表达20 min及以后的各个菌株样品观察发现，随着PlaS和egfp表达量升高，不仅荧光强度增加，而且整个大肠杆菌中都会充盈绿色荧光，不易捕捉目的视野与画面，故取诱导表达15 min为PlaS亚细胞定位最佳取样时间。本实验证明PlaS在大肠杆菌中定位于细胞膜上，属于膜蛋白，且可以正确折叠并表达。

图5 PlaS在大肠杆菌中的亚细胞定位（×600，聚焦倍数6.4）Fig. 5 Subcellular localization of PlaS in Escherichia coli(magnification × 600 and zoom × 6.4)

3 结 论

研究了黏质沙雷氏菌磷脂酶A1辅助蛋白PlaS对宿主大肠杆菌BL21（DE3）细胞膜性能和组成的影响与变化，并对PlaS的亚细胞水平定位进行了验证。结果表明，磷脂酶A1辅助蛋白PlaS在宿主大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达8 h后，能够导致宿主细胞膜的内外膜通透性明显提高，流动性与表面疏水性明显下降，表明细胞膜已遭破坏，宿主细胞发生损伤。PlaS在宿主中的表达，也引起了细胞膜脂肪酸种类与含量发生变化，直链饱和脂肪酸和反式单不饱和脂肪酸的增多以及顺式单不饱和脂肪酸的减少导致细胞膜脂肪酸不饱和度上升，刚性增加、流动性降低，这与细胞膜流动性实验结果一致。另外，激光共聚焦实验也验证了PlaS的亚细胞定位于细胞膜上，属于膜蛋白。总之，这些结果将成为PlaS抑制宿主菌生长的靶点是细胞膜的直接证据，将有助于发掘PlaS对细菌生长产生抑制作用的深层次机理，PlaS蛋白的N端前27 个氨基酸序列，可能成为将来研究抑制机理的重点。此外，实验数据可能为磷脂酶A1产生菌提高酶活性和产量与PlaS的功能开发方面带来新的启示。