基于GC-TOF-MS的大黄鱼鱼卵鱼露快速发酵过程中代谢产物分析

周 静，张华丹，火玉明，雷彩玲，杜希萍，梁 鹏,*，程文健，陈丽娇

（1.福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002；2.闽台特色海洋食品加工及营养健康教育部工程研究中心，福建 福州 350002；3.福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建 厦门 361021）

鱼露制品因其独特的香气和口感深受消费者欢迎。研究表明，鱼露富含人体所需的必需氨基酸、多种矿物质元素和维生素等营养成分，此外，鱼露还具有降血压、降低胆固醇、抗氧化等生理功效[1]。传统鱼露工艺是由低价值鱼类或加工过的鱼类废弃物与盐混合制成，通过水解和微生物发酵，发酵过程通常需要6～18 个月[2]。并且可能会产生让人难以接受的不良气味。因此，近年来国内外学者研究出外加酶、外加曲和保温发酵等快速发酵技术[3]，如Nguyen等[4]从鱼露发酵池中分离了SPQ耐盐杆菌（Marinococcus halotoleransSPQ）并接种到凤尾鱼鱼露的发酵液中进行发酵。结果表明在接种后第6个月的培养液中氨基酸态氮质量浓度为2.52 g/L，高于对照组的2.21 g/L，组胺质量浓度为110.12 mg/L，低于200 mg/L的最大允许安全限值，天冬氨酸和谷氨酸分别增加23.5%和35.1%。Lopetcharat等[5]通过研究发现，太平洋鳕鱼鱼露在50 ℃条件下进行发酵，鱼露中总氮含量在15 d时就达到了商售鱼露的水平，说明保温发酵可以加快鱼露的成熟。Rabie等[6]以鲭鱼为原料，添加菠萝蛋白酶制备鱼露，在不影响产品质量的前提下将鱼露的发酵时间缩短至90 d。由此可见，快速发酵工艺不仅可以缩短传统鱼露的发酵周期，还可以改善鱼露的风味、提高鱼露的品质。大黄鱼是我国重要的海水养殖鱼类之一，其加工副产物鱼卵因富含二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosapentaenoic acid，DHA）以及人体所需的多种营养物质，具有较高的开发利用价值[7]。有望作为鱼露发酵的优质原料，但目前这方面的研究较少。

代谢组学包括核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技术、气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用技术和液相色谱-质谱（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）联用技术等[8]。与其他技术相比，色谱-质谱技术具有灵敏度高、分辨率高等优点，而发酵食品中含有多种小分子代谢物，极性跨度大，并表现出较大的集中动态范围[9]。因此色谱-质谱技术在发酵代谢产物分析方面具有一定的优势，有望用于分析发酵食品加工过程中代谢产物组成及其形成机制。如李文亚等[10]采用GC-MS技术对不同温度下的低盐虾酱发酵过程中的代谢物进行监测，结果表明与传统虾酱相比，10 ℃下发酵的低盐虾酱不仅含盐量降低，而且营养特性较高。Lin Fengke等[11]基于气相色谱-飞行时间质谱（gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry，GCTOF-MS）技术对来自中国西南部的本土发酵食品——老窝火腿发酵过程中的代谢产物进行分析，结果表明大多数氨基酸的相对含量在成熟两年的老窝火腿样品中最高，食用老窝火腿有助于人类饮食的微生物和化学多样性。He Yingxia等[12]将GC-TOF-MS技术与描述性感官分析相结合，分析中国不同地区的浓香型白酒的差异，结果表明58种香气化合物在四川和江淮地区的样品中存在显著差异，揭示此方法在其他酒精饮料的风味表征中可能有积极应用。

近年来，课题组在大黄鱼鱼卵鱼露发酵工艺方面开展相关研究工作，如周静等[13]通过对大黄鱼鱼卵进行快速发酵，得出15%加盐量、15%加曲量、35 ℃为大黄鱼鱼卵鱼露发酵的适宜工艺条件。而当前采用代谢组学技术在鱼卵鱼露发酵品质方面的研究较少，大黄鱼鱼卵鱼露发酵过程中的代谢产物及其参与的代谢通路尚不明确。因此本实验以大黄鱼鱼卵为鱼露发酵原料，采用外加酶、外加曲、保温发酵相结合的方法快速发酵获得大黄鱼鱼卵鱼露制品，并尝试采用代谢组学技术系统地揭示大黄鱼鱼卵鱼露发酵过程中形成的代谢产物及其代谢通路与形成机制，旨在为我国鱼露发酵行业的发展提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大黄鱼鱼卵 福建蔡氏水产有限公司；木瓜蛋白酶（酶活力为8×105U/g） 北京索莱宝科技有限公司；黑曲精 上海佳民酿造食品有限公司；米曲精 济宁玉园生物科技有限公司；盐、豆粕、麸皮 市购；甲醇、乙腈、异丙醇 美国赛默飞世尔科技有限公司；甲氧胺 美国Sigma公司；双(三甲基硅基)三氟乙酰胺（bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide，BSTFA） 梯希爱（上海）化成工业发展有限公司。

1.2 仪器与设备

H1850-R冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；QL-866混匀仪 Vortex Mixer公司；5305真空浓缩仪 美国Eppendorf公司；DHG-9240鼓风干燥箱上海一恒科学仪器有限公司；7890B气相色谱仪 美国Agilent公司；Pegasus BT质谱仪 美国LECO公司。

1.3 方法

1.3.1 曲霉的制备

复合曲由黑曲霉和米曲霉组成，质量比为1∶3[14]。

黑曲霉制备：以豆粕和麸皮（质量比为豆粕∶麸皮=3∶1）为发酵基料，80%（水/干料）的去离子水润湿20 min，高压灭菌锅120 ℃蒸煮20 min，黑曲霉接种量为0.3%，在30 ℃下培养48 h[14]。

米曲霉制备：以豆粕和麸皮（质量比为豆粕∶麸皮=2∶1）为发酵基料，80%（水/干料）的去离子水润湿20 min，高压灭菌锅120 ℃蒸煮20 min，米曲霉接种量为0.3%，在30 ℃下培养44 h[14]。

1.3.2 鱼露发酵工艺

将100 g大黄鱼鱼卵解冻后剪碎，加入300 g的去离子水（质量比为鱼卵∶水=1∶3），边搅拌边将pH值调至6.5，加入3 g（鱼卵质量3%）的木瓜蛋白酶后将混合液放入50 ℃的水浴锅中酶解4 h（每隔半小时搅拌1 次），酶解结束后放入90 ℃水浴锅中灭酶15 min，拿出后冷却至室温，加入酶解液质量15%的复合曲、15%的盐，放入35 ℃的保温箱发酵，每天搅拌1 次，并且每隔5 d取样1 次（依次命名样本K-5、K-10、K-15、K-20、K-25、K-30）。

1.3.3 代谢物处理

1）将样品充分振荡混匀后，精确移取样本500 μL于2 mL EP管中，准确加入500 μL乙腈-异丙醇-水（3∶3∶2，V/V）混合溶液溶液（－20 ℃），涡旋振荡30 s。2）室温超声5 min。3）14 000 r/min离心5 min，取上清液500 μL溶液加入到一新的2 mL EP管中，真空浓缩仪浓缩至尽干（8～10 h），剩余浓缩的上清液放置－80 ℃冰箱备用。4）在浓缩尽干的样品中，加入80 μL的20 mg/mL甲氧胺吡啶溶液复溶，涡旋振荡30 s，60 ℃孵育60 min。5）再最后 加入100 μL BSTFA-TMCS（99∶1，V/V）衍生化试剂，涡旋振荡30 s，70 ℃条件下孵育90 min，14 000 r/min离心3 min，取上清液90～100 μL加入到检测瓶中。6）样品放置于密封盅内暂存待测，并于24 h内完成GC-TOF上机检测[15]。

1.3.4 检测条件

GC条件：DB-5MS毛细管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；升温程序：初始温度50 ℃，保持0.5 min，以15 ℃/min上升到320 ℃，320 ℃，保持9 min；载气（氦气）流速1 mL/min；进样量1 μL；分流比1∶10；进样口温度280 ℃；传输线和离子源温度分别为320 ℃和230 ℃。

MS条件：全扫描方法；扫描速率10 spec/s；电子能量－70 eV；溶剂延时3 min[16]。

1.4 数据处理

利用R（v3.3.2）的XCMS程序包进行峰识别、峰过滤、峰对齐，得到包括质核比和保留时间及峰面积等信息的数据矩阵；结合AMDIS程序进行代谢物的注释，对数据进行峰面积的总峰面积归一化。在对代谢组学数据进行多元统计分析之前，需要将数据进行标准化处理，使用的是帕莱托换算（Pareto scaling，Mean-centering and scaled to pareto variance，Par）。使用SIMCA-P(v13.0)进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA），通过R（v3.3.2）中pheatmap程序包对数据集进行缩放，得到代谢物相对定量值层次聚类图。通过Metaboanalyst中的MetPA数据库对差异代谢物的代谢通路进行分析。

2 结果与分析

2.1 大黄鱼鱼卵鱼露发酵过程中代谢物多元统计分析

2.1.1 PCA结果

图1 大黄鱼鱼卵鱼露差异代谢物的PCA得分图Fig. 1 PCA score plot of differential metabolites in large yellow croaker roe sauce

从图1可观察样品的聚集、离散程度。不同样品的分布点越靠近，说明这些样品中所含有的变量（分子）的组成和浓度越接近；反之，样品点越远离，其差异越大。模型的可解释度为0.506高于0.5，说明所得到的模型准确性较好。如图1所示，K-5和K-10组内分别有一个样品与其余2 个样品之间存在一定的距离，可能是实验存在的误差导致。其余样本的平行样品都较为集中。此外，大黄鱼鱼卵鱼露发酵5、10、15、20、25 d与30 d的大黄鱼鱼卵鱼露样本距离较远，说明鱼露发酵前期与后期的代谢产物差异较大，变化较为明显。

2.1.2 OPLS-DA结果

图2 大黄鱼鱼卵鱼露差异代谢物的OPLS-DA得分图Fig. 2 OPLS-DA score plot of differential metabolites in large yellow croaker roe sauce

2.2 大黄鱼鱼卵鱼露发酵过程中差异代谢物的筛选

根据P值不大于0.05且变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值不小于1的筛选条件[18]判断大黄鱼鱼卵鱼露发酵过程中的明显差异代谢物，一共得到46种。如表1所示，其中包括10种糖、9种醇、7种氨基酸、6种有机酸、4种酯、3种醛、1种脂肪酸以及6种其他化合物。通过对46种初级代谢物进行凝聚层次聚类热图分析得到图3结果表明，大黄鱼鱼卵鱼露发酵过程中代谢物被分为2 个大类，每个大类有2 个亚类，共4 个亚类。第1大类第1亚类有1种醛；第1大类第2亚类有24种，分别为6种糖、5种有机酸、5种醇、2种酯、1种醛、1种脂肪酸、1种氨基酸和3种其他化合物；第2大类第1亚类有19种，分别为6种氨基酸、4种醇、4种糖、1种醛、1种有机酸和3种其他化合物；第2大类第2亚类有2种酯。

糖类作为差异代谢物最多的种类，其中的葡萄糖如蜜二糖和3,6-脱水葡萄糖等作为鱼露中的主要碳水化合物，随着鱼露发酵的进行，其含量在不断下降，说明鱼露的发酵过程在不断消耗碳水化合物。D-木糖存在于动物的糖蛋白中，被广泛应用于焙烤食品、水产品、腊肉、等产品的生产、加工中，并且可以改善肉制品的异味。且D-木糖具有活化人体肠道内的双歧杆菌并促进其生长，改善人体的微生态环境，提高机体免疫力的功效[19]。鱼露发酵过程中D-木糖的相对含量在发酵15 d及以后有所上升。6-脱氧己糖是由核苷二磷酸激活的己糖通过4-酮-6-脱氧中间物形成，6-脱氧己糖存在于脂多糖、胞外多糖、糖蛋白和不同种类的糖基化次生代谢产物中[20]。在鱼露的发酵过程中，D-木糖和6-脱氧己糖的相对含量呈增加趋势。说明发酵过程中鱼露中的糖蛋白在不断被消耗，从而产生D-木糖和6-脱氧己糖。

醇类物质中的植物鞘氨醇是神经酰胺的前体，同时也是皮肤脂质成分之一，Kim等[21]合成了植物鞘氨醇衍生物，并将其应用于小鼠成功证明其具有减轻炎症性皮肤损伤的功能。麦芽糖醇是一种新型的功能性甜味剂，被人体吸收的比例较低，因此可作为糖尿病人的调味剂[22]。目前麦芽糖醇的主要来源是淀粉，因此鱼露中的麦芽糖醇来源最有可能是米曲霉和黑曲霉的培养原料豆粕和麸皮。1-苯乙醇又名苏合香醇，具有淡栀子花香味，是一种较为重要的食用香料用芳香化合物，被广泛用于调配各种食用香精，也被认为是发酵食品的香味贡献者。Dong Fang等[23]利用稳定同位素标记的方法，发现1-苯乙醇来源于苯丙氨酸通路中的苯乙酮，鱼露发酵过程中的1-苯乙醇的相对含量不断上升，30 d的相对含量较高，这与王洁茹等[24]对南疆红枣醋香气成分分析的研究结果类似。肌醇被认为是一种类似维生素的必需营养素，是大多数水生动物的生长因子。有研究报道，缺乏肌醇的虾的消化和食物利用率较低，而随着肌醇水平的增加，虾体内的消化酶活性提高，消化能力和生长性能随之提高[25]。

氨基酸作为鱼露独特口感的直接原因，在检测到的46种明显差异代谢物中有7种，分别是L-异苏氨酸、DL-苏氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸和L-丝氨酸、DL-焦谷氨酸，其中有4种为人体必需氨基酸（苯丙氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、缬氨酸）。异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸为苦味氨基酸，苏氨酸为甜味氨基酸，另外丝氨酸是鱼露鲜味形成的关键氨基酸之一[26]。随着发酵的进行，苏氨酸的相对含量有所增加，而其余6种氨基酸的含量在不断减少，这与Wang Yueqi等[9]对中国传统鱼露的代谢产物研究结果一致。

差异代谢物中的有机酸包括琥珀酸、丁烯二酸、异戊酸、2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-甲基戊酸、D-阿拉伯酸、D-甘油酸，琥珀酸是鲜味的载体，能够协同其他物质起到增强呈味的作用，是水产品重要的滋味物质之一[27]，琥珀酸（包括盐类）可产生酸味、呈味，可用于豆酱、调味料等食品中。D-阿拉伯酸、D-甘油酸、琥珀酸、2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-甲基戊酸、异戊酸和EPA都随着发酵的进行含量不断增加，特别是D-阿拉伯酸、D-甘油酸、2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-甲基戊酸以及EPA在发酵第30天含量最高。

酯类是发酵生成的羧酸和醇的酯化作用的产物，存在于生的、烤的和发酵食品的挥发物以及甲壳类鱼肉等海鲜中[28]。鱼露发酵过程产生的差异代谢物中脂类有4种，分别为莽草酸酯、乙酸甲酯、壬酸甲酯以及2-氧代-4-甲基戊酸甲酯，这些酯质与其他物质相互作用，共同构成鱼露的特殊风味。其中乙酸甲酯是国家规定食品中可食用的香精，主要呈味为果香。醛类在鱼露的风味形成中也不可或缺。差异代谢物中的苯乙醛是由苯丙氨酸通过Strecker途径降解生成，表现出玫瑰花香[29-30]。在鱼露的发酵过程中，苯乙醛的含量不断升高，说明鱼露的香味成分在不断形成。

鱼露的差异代谢物中只检测到1种多不饱和脂肪酸，即为EPA，其能预防老年痴呆症和抗炎症，有效降低心血管疾病的发病率，对人与动物的生长发育起着重要作用[31]。由图3可以看出，EPA的相对含量在发酵过程中不断增加，在发酵第30天相对含量较高。鱼露中的其他化合物包括呋喃、酮和酚类化合物。呋喃是由美拉德反应或氨基酸的热分解产物产生的，酮类与脂肪酸氧化有关。

表1 大黄鱼鱼卵鱼露发酵过程中的显著差异代谢物Table 1 Significantly differential metabolites in large yellow croaker roe sauce during fermentation

图3 大黄鱼鱼卵鱼露发酵过程中差异代谢物层次聚类分析热图Fig. 3 Heat map of hierarchical cluster analysis of differential metabolites in large yellow croaker roe sauce during fermentation

2.3 差异代谢物通路分析

KEGG是一个整合了基因组、化学和系统功能信息的数据库，通路数据库通过代谢通路浓缩和拓扑分析，识别出可能的受发酵时间段影响的代谢通路[32]。如图4、表2所示，根据代谢通路影响值从大到小的代谢通路分别为缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成，蛋白质消化吸收，半乳糖代谢，氨酰-tRNA生物合成，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，硫代葡萄糖苷生物合成，三羧酸循环，氨基酸的生物合成，莽草酸类生物碱的生物合成，磷酸肌醇代谢，不饱和脂肪酸的生物合成。影响值分别为0.130 43、0.106 38、0.086 957、0.076 923、0.06、0.051 948、0.05、0.04 687 5、0.041 667、0.021 277、0.013 514。在所有代谢通路中，氨基酸的生物合成与其他代谢通路存在密切联系。

图4 大黄鱼鱼卵鱼露差异代谢物的代谢通路影响因子图Fig. 4 Metabolic pathways regulating differential metabolites in large yellow croaker roe sauce

如图5所示，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成与甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢密切相关。表现为甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路中所产生的苏氨酸经苏氨酸脱水酶脱氨脱水形成α-酮丁酸，再和丙酮酸在乙酰乳酸合酶的作用下合成α-乙酰-α-羟丁酸，经乙酰乳酸变位酶/还原酶合成α,β-二羟-β-甲基戊酸，接下来经二羟酸脱水酶合成α-酮-β-甲基戊酸，结合谷氨酸在分支链氨基酸谷氨酸转氨酶作用下最终合成异亮氨酸。缬氨酸和亮氨酸的合成首先由丙酮酸脱羧后与另一个丙酮酸缩合，形成α-乙酰乳酸。然后还原、变位、脱水形成α-酮异戊酸。这是一个分支点，如果转氨可生成缬氨酸，否则就与乙酰辅酶A缩合，进入亮氨酸支路，形成α-酮异己酸再转氨，即生成亮氨酸。

表2 大黄鱼鱼卵鱼露发酵过程中代谢通路分析表Table 2 Metabolic pathway analysis of large yellow croaker roe sauce during fermentation

图5 缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成途径Fig. 5 Biosynthetic pathways of valine leucine and isoleucine

发酵环境中的淀粉水解成葡萄糖，通过糖酵解途径生成丙酮酸。丙酮酸氧化脱羧后生成乙酰辅酶A进入三羧酸循环促进琥珀酸等有机酸的形成，促进鱼露独特风味的形成。丙酮酸与糖酵解的中间产物3-磷酸甘油醛缩合生成1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸（1-deoxy-D-xylose 5-phosphate，DXP），乙酰辅酶A生成β-羟基-β-甲基戊二酸单酰辅酶A（β-hydroxyl-β-methylglutaric acid monoacyl coenzyme A，HMG-CoA）。L-半乳糖-1-磷酸酯酶由DXP经MEP/DOXP途径或HMG-CoA经甲羟戊酸途径生成后进入萜生物碱类的代谢。

丝氨酸来源于糖酵解的中间体——3-磷酸甘油酸酯，甘氨酸来源于丝氨酸。苏氨酸是一种动物无法合成的必需氨基酸，而在细菌和植物中，苏氨酸来源于天冬氨酸。因此鱼露中的苏氨酸主要由发酵体系中的细菌以及植物产生。硫代葡萄糖苷生物合成代谢途径中，原料来源分别为蛋氨酸、芳香族氨基酸、支链氨基酸3种。

其次，通过KEGG等权威代谢物数据库对差异代谢物进行映射，反映出具有极显著差异的代谢物有15 个[33]。分别为L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-丝氨酸、L-苯丙氨酸、肌醇、α-D-葡萄糖、半乳糖甘油、甘氨酸、DL-苏氨酸、2-氧代-4-甲基戊酸甲酯、莽草酸酯、琥珀酸、EPA、甘油。从图6可以直观比较大黄鱼鱼卵鱼露发酵过程中15种关键代谢物的相对含量差异。其中L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-丝氨酸、L-苯丙氨酸参与了蛋白质消化吸收，氨酰-tRNA生物合成，氨基酸的生物合成。L-苯丙氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸参与了硫代葡萄糖苷生物合成，甘氨酸、L-丝氨酸和DL-苏氨酸参与了甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸参与了缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成。氨基酸类的差异代谢物参与了多条代谢通路，说明氨基酸对于代谢通路的影响较大，同时也说明在大黄鱼鱼卵鱼露发酵过程中，氨基酸的相对含量变化较大代谢助力了大黄鱼鱼卵鱼露风味的形成。琥珀酸主要参与三羧酸循环和莽草酸类生物碱的生物合成，α-D-葡萄糖主要参与了半乳糖代谢和莽草酸类生物碱的生物合成，肌醇参与了磷酸肌醇代谢，EPA参与了不饱和脂肪酸的生物合成。

图6 大黄鱼鱼卵鱼露发酵过程中15种关键代谢物相对含量箱形图Fig. 6 Box plots of relative contents of 15 key differential metabolites in large yellow croaker roe sauce during fermentation

3 结 论

基于GC-TOF-MS建立大黄鱼鱼卵鱼露发酵过程中不同时间段的代谢产物的分析方法，用于揭示大黄鱼鱼卵发酵过程中形成的差异代谢产物及其代谢通路。以P值不大于0.05且VIP值不小于1为筛选条件得到包括糖类、醇类、氨基酸、酯类、醛类等在内的46种差异代谢物。进一步对差异代谢物的代谢通路进行分析，发现缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成，蛋白质消化吸收，半乳糖代谢，氨酰-tRNA生物合成，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，硫代葡萄糖苷生物合成，三羧酸循环，氨基酸的生物合成，莽草酸类生物碱的生物合成，磷酸肌醇代谢，不饱和脂肪酸的生物合成等11 条关键代谢通路，并且发现影响代谢通路的15种极显著差异的代谢物种氨基酸类代谢物参与了多条代谢通路。本方法的建立和代谢产物的分析，为大黄鱼鱼卵鱼露的工业化生产提供了理论支持，对于大黄鱼鱼卵鱼露的发酵过程进行质量控制有重要意义。