溴结构域蛋白4在心血管疾病中的研究进展

刘 彬 江立生

溴结构域和额外终端域(bromodomain and extra terminal domain，BET)家族蛋白是一类染色质蛋白，其成员包括溴结构域蛋白(bromodomain protein，BRD)2、BRD3、BRD4和BRDT，主要通过介导蛋白质间相互作用来调节转录因子的活性[1]。BRD2在精母细胞和圆精细胞等细胞中均有表达，具有激酶活性，调节机体能量平衡；BRD3在睾丸、卵巢、子宫、胎盘及大脑中高表达，与乙酰化的红系特异性转录因子(GATA1)结合，在造血过程中起转录调节作用；而BRD4在人体中表达极为广泛，在多种癌细胞及纤维化细胞中呈高表达；BRDT则在睾丸中特异性表达，对精子基因表达尤为重要[2]。BET蛋白有两个保守的氨基末端溴域和一个羧基末端“超末端”结构域，其中溴域结构有4个α螺旋，并由可变环区隔开，形成识别乙酰赖氨酸残基的疏水空腔[3]。除与组蛋白中的乙酰化赖氨酸相互作用外，BET蛋白还与转录延伸复合体的成员和其他转录因子相互作用。BET蛋白是正常细胞和转化细胞表观遗传信息的关键“读取器”，在癌症的发生、发展过程中发挥重要作用。在多种心血管疾病发展过程中，调控BET蛋白则是一种在细胞分化、识别和细胞状态转变中控制基因表达的手段，其中以BRD4的调控最为重要，其有望成为新的治疗靶点[4-7]。

1 BRD4在动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)中的作用

脂质积聚是AS形成的重要始动因素之一。除降低低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)水平外，提高高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)水平也是预防AS的有效方法。作为HDL颗粒的主要蛋白载体，载脂蛋白A-Ⅰ(apoA-Ⅰ)可提高前HDL-β1的水平并促进HDL的成熟[8]。Mclure等[9]研究结果表明，抑制BRD4可提高apoA-Ⅰ和HDL的水平，进而促进胆固醇动员并延缓AS的进展。也有研究[10]显示，部分敲除小鼠脂肪组织BRD4基因可显著减轻其体重，BRD4特异性抑制剂JQ-1可缩小棕色脂肪的体积，抑制葡萄糖的吸收和后续产热。

内皮细胞损伤也是AS进展的重要机制。研究[6]显示，沉默人脐静脉内皮细胞中的BRD2、BRD3或BRD4基因可降低TNF-α诱导的炎症基因的表达，其中BRD4基因起关键作用。BRD4特异性抑制剂如JQ-1处理的内皮细胞，可阻断TNF-α诱导的血管细胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule，VCAM)1等多种促炎和致AS内皮基因的表达，以及白细胞黏附和跨内皮迁移。动物实验表明，体内注射BRD4抑制剂对LDL受体缺陷小鼠模型的AS进展也起到延缓作用[11]。由此可知，抑制BRD4可保护血管内皮功能，对预防AS和延缓其进展具有一定意义。

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)从中膜到内膜的增殖和迁移是AS进展过程的重要特征之一[12]。任何改变VSMC对机械力和损伤因子刺激的反应，都可诱导增殖性血管内膜增生，BET家族成员中BRD4被认为是决定VSMC表型和病理状态的关键因素[13]。BET还参与了一种被称为“内皮到间质转变(EndMT)”的跨越内皮细胞(EC)和VSMC的血管重构机制[14]，而BRD4对这一机制起控制作用[15]。研究[16]显示，通过转染Pin1质粒载体上调VSMC的Pin1表达可促进高糖诱导的BRD4表达，并刺激细胞增殖和迁移，而JQ-1可抑制高糖诱导的VSMC的BRD4蛋白表达，提示抑制Pin1/BRD4通路或可改善糖尿病动脉粥样硬化，其机制可能与抑制VSMC的增殖和迁移有关。

炎症反应在整个AS形成和进展过程中起关键作用。在炎症因子作用下，炎症信号导致NF-κB从细胞质移动到细胞核，后者被p300乙酰化后与BRD4相互作用，并招募BRD4作为促炎基因的增强子和启动子，形成超级增强子(superenhancers，SEs)位点[17]。促炎SEs的形成会因为染色质中BRD4基因的缺失而受到抑制，影响SEs相关基因的表达，从而阻碍白细胞在内皮中的滚动、黏附和迁移[11]。研究[18]发现，BRD4抑制剂Apabetone(又称RVX-208)可以抑制炎症诱导的BRD4在血管内皮细胞炎症基因的增强子和启动子上积聚，以及后续与炎症、内皮功能障碍、单核细胞募集和斑块不稳定相关的基因转录。此外，BRD4过表达不仅上调活性氧(ROS)的生成[19]，还诱导IL-8的转录[18]，两者都通过促进基质降解导致斑块不稳定。上述研究提示，抑制BRD4可延缓血管炎症进展，对维护粥样斑块的稳定性也具有一定益处。

2 BRD4在心肌梗死中的作用

心肌梗死是心肌发生缺血坏死的病理过程，是冠状动脉粥样硬化的最严重表现形式。有研究发现，BRD4蛋白在心肌梗死大鼠模型心肌细胞和缺氧心肌细胞中的表达水平均显著升高，并伴有利钠肽A (ANP)和利钠肽B (BNP)表达水平的升高；而敲除BRD4可显著下调体内外ANP和BNP的表达，减少细胞凋亡，改善心力衰竭大鼠血流动力学和生物特征参数。体外研究[20]进一步证实，BRD4与乙酰化RelA结合可增强NF-κB信号通路的激活，从而促进ANP和BNP转录。此外，在冠状动脉结扎大鼠心肌梗死模型中，使用JQ-1预处理可显著降低24 h内心肌梗死标志物的水平[21]，提示抑制BRD4可能对延缓心肌梗死的进展具有积极作用。另一项研究[22]证明，抑制BRD4可通过PI3K/AKT通路阻止foxo4依赖的ROS生成，从而阻断了肾细胞凋亡和内质网应激蛋白的表达，这为治疗心肌缺血再灌注损伤提供了新思路。

3 BRD4在心力衰竭中的作用

心力衰竭是心血管疾病的最严重阶段，死亡率高且预后不良。心室重构是心力衰竭发生、发展的基本机制，通常以病理性肥大、心肌细胞死亡和细胞外基质过度纤维化为特征。研究[23]结果表明，BRD4在心肌肥大过程中是病理基因反式激活的关键辅助激活因子，其机制包括招募正转录延伸因子b(P-TEFb)活性和暂停释放POL-Ⅱ，在不同小鼠心力衰竭模型的心肌细胞和药物诱导多能干细胞来源的心肌细胞中控制着纤维化进程和炎性转录网络。在培养的新生大鼠心室肌细胞中，小干扰RNA介导的BRD4沉默或应用JQ-1可阻断心肌细胞病理性肥大；在小鼠压力超负荷初始期及早给予JQ-1可遏制心肌肥厚和左心室收缩功能障碍的进展[23]。抑制BRD4的表达可通过减少ROS的产生、抑制纤维化和炎症，显著减轻压力超负荷或AngⅡ诱导的心肌肥厚[24]。值得关注的是，已经发现BRD4信号与运动诱导的心肌细胞生理性肥大无显著相关性[23]。

BRD4可能通过调节TGF-β和丝裂原活化蛋白激酶的表达，诱导静止的心脏成纤维细胞转化为产生细胞外基质成分的细胞，从而控制心脏纤维化和心力衰竭[25]。BRD4介导的EndMT调节过程也参与心脏纤维化的发生、发展，抑制BRD4可阻止主动脉缩窄或TGF-β诱导的心肌纤维化，其部分机制为JQ-1通过靶向TGF-β受体1来减弱TGF-β诱导的EndMT；其中由TGF-β激活的Smad通路也参与了EndMT，而抑制BRD4功能可使该信号通路失活[15]。心肌细胞中许多富含BRD4的超级增强子与促纤维化基因表达有关，包括结缔组织生长因子、纤溶酶原激活物抑制物-1和TGF-β[26]。这些研究结果表明，BRD4可能对心脏纤维化具有促进作用，抑制BRD4可能是延缓心脏纤维化的有效策略。

最近的研究发现，BRD4蛋白在维持心肌收缩功能和线粒体内稳态方面也发挥着不可或缺的作用。通过心肌细胞特异性BRD4缺失模型，发现BRD4调节心肌线粒体基因的表达。BRD4蛋白的缺失导致核编码的关键线粒体基因，以及参与线粒体质子梯度(ETC)偶联的基因表达显著下调。这些变化导致心肌细胞耗尽与ETC和代谢物循环(三羧酸循环和脂质氧化)有关的关键酶，造成心室收缩能力进行性下降、心室扩张和心肌病，证明了BRD4在维持正常心肌细胞生物学方面的生理作用[27]。另一项研究发现，成年小鼠心肌细胞特异性BRD4基因的缺失导致心肌收缩功能的急性恶化，突变动物表现出丰富的转录特征，线粒体能量产生的关键基因的表达显著降低。BRD4优先与GATA4共定位，GATA4是一个决定心脏转录因子的谱系，BRD4和转录因子GATA4共同占据了参与成年心肌细胞线粒体能量产生的转录本的启动子区域。BRD4和GATA4在心肌细胞中形成内源性复合物，并以溴域非依赖的方式相互作用。BRD4-GATA4模块控制线粒体代谢的上游转录辅助激活因子及其下游基因靶标的表达。这提示BRD4-GATA4模块是成人心脏中线粒体生物能量学的重要协调者[28]。上述研究结果表明，BRD4的功能可能对维持正常的心功能是不可或缺的。

4 BRD4在心肌病中的作用

糖尿病性心肌病是导致糖尿病患者最终心力衰竭的复杂事件。在高糖刺激的心肌成纤维细胞和心肌细胞中，BRD4表达增加，伴有明显的肌成纤维细胞分化和心肌细胞凋亡。JQ-1治疗可抑制STZ(链唑霉素)诱导的糖尿病小鼠模型的心脏纤维化和改善心功能，其减轻心肌纤维化的机制与调控Caveolin-1/TGF-β1/Smad3信号通路有关；此外，JQ-1不仅显著抑制高血糖诱导的心脏成纤维细胞增殖和迁移、肌成纤维细胞分化和胶原生成，还可抑制心肌细胞凋亡[29]。在高脂饮食诱导的糖尿病性心肌病中，心脏组织BRD4表达上调，后者对PINK1/Parkin介导的线粒体自噬起抑制作用，并进一步损害线粒体和心脏的结构与功能，而使用JQ-1则对这一过程起修复作用[30]。核纤层蛋白基因LMNA突变是原发性扩张型心肌病的主要致病机制，心肌细胞LMNA基因的缺失与BRD4的激活有关；而JQ-1可部分恢复失调基因的表达，提高LMNA基因敲除小鼠模型的存活率，改善心功能，抑制心肌纤维化和细胞凋亡[31]。综上，调控BRD4或可成为心肌病治疗的潜在靶点。

5 BRD4在肺动脉高压(pulmonary artery hypertension, PAH)中的作用

PAH是一种以肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖和凋亡抑制为特征的血管病变。BRD4在PAH中表达增加[32]，而RVX-208可通过阻断BRD4-FOXM1-PLK1信号通路逆转不同PAH模型大鼠的血管重构，改善右心室功能和肺血流动力学[33]。此前，JQ-1也被报道可以显著改善PAH大鼠模型的肺血流动力学，降低肺动脉壁厚度，逆转PAH[34]。作为PAH血管重塑的重要组成部分，血管生成是一个多步骤的过程，依赖于内皮细胞增殖、迁移到周围组织并分化为新的毛细血管。体外研究[35]结果表明，BRD4通过调节p21激活激酶1和血管内皮生长因子受体介导的内皮型一氧化氮合酶(eNOS)信号转导，促进内皮细胞肌动蛋白细胞骨架的增殖、迁移和重组，促进血管生成。正在进行的一项针对RVX-208治疗PAH的临床试验(NCT03655704)已经显示出良好的安全性，预期结果值得期待。

6 BRD4在高血压中的作用

Yang等[36]的研究结果显示，BRD4在原发性高血压患者中表达增加，并与患者的血压呈正相关。抑制BRD4可显著降低高血压大鼠血浆AngⅡ和内皮素-1(ET-1)水平，显著升高一氧化氮合酶(NOS)和NO水平；经BRD4抑制剂治疗后，自发性高血压大鼠血浆中超氧化物歧化酶活性显著增强，而丙二醛、IL-6和TNF-α水平显著降低，提示BRD4可能也参与高血压病的调节过程[36]。

7 展 望

作为表观遗传信息的“读取器”，BRD4通过识别乙酰化组蛋白、向染色质招募转录因子和共激活因子来控制基因的转录，促进转录的起始和延伸。BRD4有助于协调涉及内皮、血管平滑肌细胞、炎症和心肌的转录程序，指导分化、细胞特性和细胞状态转变，以应对心血管系统中常见的病理变化。然而，表观遗传调控因子无处不在的特点给心血管疾病的靶向表观遗传疗法的开发带来了巨大的挑战。尽管抑制BRD4对AS、心力衰竭、高血压、心肌病和PAH等心血管疾病表现出潜在治疗价值，但抑制或激活这些调节因子不具有心血管特异性，可能还具有多效性和靶外毒副作用。因此，针对BRD4进行心血管药物研究时，有必要对不同类型的心血管疾病和组织细胞开展特异性研究，确定心血管疾病特异性基因及其相应的表观遗传调节因子，并在表观遗传改变和信号转导级联之间建立网络，为开发更具组织特异性和无明显毒副作用的BET抑制剂提供基础。