Foxp3/SMARCE1信号轴促进宫颈癌细胞侵袭和迁移

龙嘉莉，刘曙光，马红梅，曾超

(中山大学附属第八医院病理科，广东 深圳 518033)

目前，宫颈癌仍是妇女癌症相关死亡的主要原因。虽然近年来宫颈癌在全世界的发病率已显著下降，但其死亡率在发展中国家仍在增加。一般来说，早期宫颈癌患者治疗后的5年生存率可达90%以上，而中晚期患者的5年生存率不到30%[1]。因此，找到驱动宫颈癌进展的因素尤为重要。本团队前期实验研究[2]发现，随着宫颈病变级别的增加，叉头样转录因子3(forkhead box protein 3，Foxp3)表达强度和阳性率增加，证实Foxp3在宫颈癌的进展过程中起着重要作用。为进一步探究Foxp3对宫颈癌生物学行为的影响及分子调控机制，本实验采用基因芯片筛选出Foxp3下游基因SMARCE1，并证实Foxp3调控SMARCE1促进宫颈癌Hela细胞的侵袭和迁移。

1 材料与方法

1.1 材料

宫颈癌Hela细胞系由本实验室保存。DMEM培养基、10%胎牛血清、胰蛋白酶、Lipofectamine 2000均购自美国赛默飞公司；蛋白浓度测量试剂盒购自上海碧云天公司；一抗兔抗人单克隆抗体Foxp3、SMARCE1购自美国Abcam公司；兔多抗GAPDH购自杭州贤至生物公司；HRP标记羊抗兔二抗购自武汉博士德公司；Transwell小室购自美国康宁公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、转染 宫颈癌Hela细胞采用含10%胎牛血清及1%青霉素和1%链霉素的RPMI-1640培养基进行培养，置于37 ℃，5% CO2培养箱中。将生长状态良好、汇合度为85%左右的细胞，用0.25%胰蛋白酶消化传代。Foxp3 shRNA序列为：

CCTCCAGAGAGAGATGGTA，质粒表达载体由上海吉玛公司合成。Foxp3 shRNA配套的阴性对照质粒的Hela细胞作为对照组。利用从Hela细胞中提取的mRNA，通过逆转录聚合酶链反应扩增人Foxp3全长cDNA。引物序列设计如下：

Foxp3-F:5-′TGGTACCGAGCTCGCCACCATGCCCACCAGGCCTGGCAAG-3′；

Foxp3-R:5-′GATATCTGCAGAATTCTCAGGGGCCAGGTGTAGGGTTG-3′。将Foxp3 DNA片段克隆入pcDNA3.1构建重组pcDNA3.1-Foxp3质粒。取对数生长期的Hela细胞进行转染，按照脂质体转染试剂Lipofectamine 2000说明书转染干扰或过表达质粒表达载体，转染对应的空质粒的Hela细胞作为对照组。

1.2.2 Western blot(WB)实验 转染后继续培养48 h后采用WB法检测Hela细胞中Foxp3的表达情况。采用BCA试剂盒进行蛋白定量，使用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，PVDF转膜、5%脱脂奶粉封闭后使用1∶1 000稀释后的一抗过夜孵育，选择HRP标记的二抗标记后采用ECL发光试剂盒显影后采用Bio-Rad凝胶成像系统检测染色条带的强度，计算目的蛋白和内参蛋白的光密度比值。

1.2.3 细胞迁移和侵袭实验 取转染24 h的后的Hela细胞，用0.25%胰蛋白酶消化收集，无血清培养基调整细胞密度为3×105个/mL备用。在24孔板中预先加入1 mL的DMEM完全培养基(含双抗)，并放入Transwell小室，1 h后在Transwell上室分别接入200 μL各组细胞悬液，37 ℃，5% CO2培养箱培养24 h。培养完成后，取出Transwell，固定、清洗后染色，于显微镜下观察拍照。侵袭实验需制备带Matrigel胶的Transwell上室，余步骤同迁移实验。

1.2.4 生物信息分析 基因芯片分析Hela细胞敲低Foxp3表达后的差异表达基因。生物信息分析由上海GENECHEM公司进行。

1.3 统计学分析

采用SPSS 23.0软件分析数据。两组间比较用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞转染效率

采用WB法观察Foxp3 shRNA转染Hela细胞的Foxp3表达情况。结果显示，Foxp3 shRNA转染组的Hela细胞中Foxp3蛋白表达比对照组下降(P<0.05)。见图1。

2.2 Foxp3 shRNA转染后对细胞迁移能力的影响

Transwell迁移实验结果表明，转染Foxp3 shRNA的Hela细胞迁移细胞数量较对照组Hela细胞细胞迁移数量少(P<0.05)。见图2。

2.3 Foxp3 shRNA转染后对宫颈癌Hela细胞侵袭能力的影响

Transwell侵袭实验结果表明，转染Foxp3 shRNA的Hela细胞侵袭细胞数量较对照组Hela细胞细胞侵袭数量少(P<0.05)。见图3。

2.4 SMARCE1是Foxp3下游表达相关基因

采用基因芯片技术寻找Foxp3下游基因。通过shRNA敲除Hela细胞中Foxp3的表达后，发现1 427个基因上调，1 511个基因下调，其中包括SMARCE1。见图4。

2.5 Foxp3 shRNA转染后宫颈癌Hela细胞SMARCE1表达下调

WB验证Foxp3 shRNA转染后Hela细胞中SMARCE1的表达情况。WB显示，转染Foxp3 shRNA后，与对照组相比，SMARCE1蛋白表达水平降低(P<0.05)。见图5。

2.6 Foxp3 shRNA和转染SMARCE1质粒共转染后宫颈癌Hela细胞迁移情况

Transwell迁移实验表明，共转染Foxp3 shRNA和SMARCE1质粒组的细胞较共转染Foxp3 shRNA和pcDNA3.1空质粒组细胞迁移数量多(P<0.05)。见图6。

2.7 Foxp3 shRNA和转染SMARCE1质粒共转染后宫颈癌Hela细胞侵袭情况

Transwell侵袭实验表明，共转染Foxp3 shRNA和SMARCE1质粒组的细胞较共转染Foxp3 shRNA和pcDNA3.1空质粒组细胞侵袭数量多(P<0.05)。见图7。

3 讨论

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，近年来更有向年轻化发展的趋势。宫颈癌的发生、发展是一个多基因改变且多步骤的复杂过程，因此，探讨宫颈癌发生发展过程中的分子机制，寻找有效分子的靶向治疗方法，将对加强和促进宫颈癌的防治工作提供实验研究的基础。

最新研究[3]表明，除了T细胞谱系之外，Foxp3在一系列癌症中表达，包括卵巢[4]、肺[5]和前列腺癌。然而，Foxp3对癌症的影响非常有争议。在结肠直肠癌[6]、黑色素瘤[7]和肺癌[8]中，高水平的Foxp3提示与不良的预后有关。相反，高水平的Foxp3却有利于乳腺癌的预后[9]。本团队前期实验发现，随着宫颈病变级别的增加，Foxp3表达强度和阳性率增加，提示Foxp3可能在宫颈病变组织水平的分化和生长中发挥重要作用[2]。研究组进一步证实，Foxp3通过外源敲低Foxp3表达抑制宫颈癌细胞的迁移和侵袭。染色质重塑对于全身性生理稳态是必不可少的。染色质重塑的异常通常导致癌症的发生和发展[10]。因此，在许多类型的癌症中经常观察到参与染色质重塑的基因突变[11]。SMARCE1是SWI/SNF染色质重塑复合物的组分，通过以ATP依赖性方式改变核小体内的DNA-组蛋白触点而改变染色质结构[12]。证据[13-15]表明，较高的SMARCE1表达与乳腺癌、胃癌和卵巢癌的预后相关，SMARCE1可以作为预测癌细胞侵袭和迁移能力的指标。在本研究中，课题组通过基因芯片分析，筛选出SMARCE1作为宫颈癌细胞中Foxp3的下游差异表达基因。此外，SMARCE1的过表达可以拮抗Foxp3敲低介导的宫颈癌细胞迁移和侵袭的抑制，表明SMARCE1至少部分促进Foxp3介导的迁移和宫颈癌细胞的侵袭。这是首次提出SMARCE1可作为Foxp3下游作用基因，并揭示了SMARCE1调节对Foxp3在宫颈癌中的致癌作用的功能意义。

综上，Foxp3可调控下游SMARCE1促进宫颈癌细胞的迁移和侵袭，该结果对Foxp3在宫颈癌中的致癌功能提供了新线索，这表明Foxp3/SMARCE1信号轴可能是宫颈癌进展的新途径。