反复种植失败的临床处理策略

王焰，孟庆霞

近年来，越来越多的生殖健康问题亟待解决。全国生殖健康流行病学调查显示，我国不孕不育发生率从2007年的12%上升至2020年的18%[1]。“怀不上、保不住、生不好”的问题已成为实现“健康中国2030”过程中重大健康及社会问题。反复种植失败（repeated implantation failure，RIF）给患者及其家庭带来沉重的经济负担和极大的身心创伤，发生率为5%～10%[2]，然而其确切的发病机制仍不明确。迄今为止，尚缺乏针对这一人群具有高级别循证医学证据的安全有效的治疗方案。导致RIF的因素众多，植入过程中胚胎与子宫内膜之间的复杂关系仍有待不断探索。本文就近年RIF的病因学研究及其临床处理策略进行综述。

1 RIF的定义

目前国内外尚无统一的RIF诊断标准。2018年中国《胚胎植入前遗传学诊断/筛查技术专家共识》中将RIF定义为移植3次及以上或移植高评分卵裂期胚胎4～6枚或高评分囊胚3枚及以上均未获得临床妊娠者[3]。2014年Coughlan等[4]提出RIF指小于40岁的女性在至少3个新鲜或冻融周期中移植至少4枚优质胚胎后未实现临床妊娠。2021年欧洲人类生殖与胚胎学学会（European Society of Human Reproduction and Embryology，ESHRE）的一项关于RIF的国际调查表示，大多数临床医生和胚胎学家将经历3个新鲜或冻融移植周期失败定义为RIF[5]。RIF的定义及诊断未达成明确共识，导致临床研究纳入的研究对象存在差异，而且有关RIF病因的筛查项目、技术受当地医疗水平的限制等，导致出现较多的不明原因RIF（unexplained repeated implantation failure，uRIF）。

2 不同病因RIF的临床处理策略

2.1 胚胎植入前遗传学检测（preimplantation genetic testing，PGT）年龄是导致RIF的重要因素。随着女性年龄增大，卵母细胞更易出现染色体不分离或畸变，导致辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）助孕时胚胎种植率下降，自然流产率增加。RIF患者行胚胎植入前非整倍体遗传学筛查（preimplantation genetic testing for aneuploidy，PGT-A）可以选择整倍体胚胎，规避因胚胎染色体异常所导致的种植失败。Tiegs等[6]的前瞻性双盲研究纳入402例进行PGT-A的18～44岁无自然流产史的第一次行体外受精/卵细胞质内单精子注射（in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection，IVF/ICSI）的患者，在单囊胚复苏周期移植时仅根据形态学选择囊胚，结果显示胚胎整倍体率为60.2%、非整倍体率为24.6%（剩下的胚胎均因未能扩增DNA、产生非同时性结果等原因未列入讨论），PGT-A对非整倍体胚胎的临床诊断准确率为100%，滋养外胚层活检组与年龄匹配的未活检组的持续妊娠率差异无统计学意义（47.9%vs.45.8%），表明使用滋养外胚层活检不会影响具有发育潜力的胚胎，也不会影响胚胎植入。虽然该研究显示PGT-A对非整倍体胚胎的诊断错误率为0%，但其在更大的样本中具有一定的错误率，约为0%～2.43%。

Tong等[7]的回顾性研究对265例RIF患者行PGTA，结果显示年龄≥38岁患者的胚胎非整倍体率（68.9%vs.39.9%）和嵌合体率（9.3%vs.5.2%）显著高于年龄＜38岁者（均P＜0.001），移植后2组胚胎种植率、生化妊娠率、临床妊娠率和早期自然流产率差异均无统计学意义。提示胚胎因素在RIF中起着至关重要的作用，女性年龄不影响整倍体胚胎的种植率。滋养外胚层活检后的囊胚存活率几乎为100%，可以提高高龄RIF患者的胚胎种植率和临床妊娠率。

PGT是通过活检滋养外胚层进行遗传学检测，存在嵌合问题。为了探讨行PGT的胚胎染色体嵌合体的真实发生率，Wu等[8]对PGT患者捐赠的101枚嵌合体胚胎再次活检（拆分滋养外胚层、内细胞团和其余部分）并进行二代测序（next-generation sequencing，NGS），结果显示53.5%的胚胎为整倍体胚胎，14.8%为新发的染色体畸变，31.7%的胚胎呈现出与原始活检结果一致的染色体畸变。因此，虽然活检滋养外胚层的PGT检测非整倍体是可靠的，但是其诊断嵌合体的能力有待探究，嵌合体的发生概率可能远低于临床观察到的，应该更多关注PGT中的假阳性和假阴性问题。

Ata等[9]对不同年龄女性的囊胚整倍体率和累积种植率进行数学建模，探讨在没有其他影响胚胎种植的因素下，实现95%累积种植率（至少有1枚胚胎植入的累积概率达到95%）所需的囊胚数量。结果显示对于未行PGT、年龄＜35岁的女性，达到95%累积种植率需要移植7枚囊胚；年龄越大，达到95%累积种植率所需的囊胚数越多，年龄＞38岁者则需要移植超过10枚囊胚。假设整倍体囊胚的种植率为55%，无论年龄大小，3～4枚囊胚足以达到90%或95%累积种植率。建议RIF应作为指导进一步治疗的功能性术语，在没有确定种植失败是非整倍体因素引起之前，不应过度强调RIF，以免过早地进行RIF相关因素的排除和治疗，导致患者的利益受损。

2.2 改善薄型子宫内膜适宜的子宫内膜厚度（8～16 mm）是胚胎种植于子宫腔内的必备条件。ART治疗过程中，在人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，hCG）日或给予黄体支持当天，B超下子宫内膜厚度＜7 mm则为薄型子宫内膜[10]。对于薄型子宫内膜患者首先进行宫腔镜检查是必不可少的，通过检查排除宫腔内异常及炎性疾病可能。薄型子宫内膜可导致RIF，而且治疗较为棘手，近年来出现了一些新的干预措施。

2.2.1 宫腔灌注粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）G-CSF可能通过调节蜕膜巨噬细胞、辅助性T细胞2（T helper 2 cell，Th2细胞）刺激子宫内膜细胞增殖，从而参与植入过程。Isik等[11]的研究将12只薄型子宫内膜大鼠和12只正常子宫内膜大鼠进一步分为宫腔灌注G-CSF组和生理盐水注射组，每组6只。结果显示宫腔灌注GCSF后薄型子宫内膜组子宫内膜厚度得到明显改善，而正常子宫内膜组未发生改变；灌注G-CSF的薄型子宫内膜组增殖细胞核抗原和血管内皮细胞生长因子2表达显著升高，细胞凋亡显著减少。这表明GCSF可以明确改善薄型子宫内膜的内膜厚度、细胞增殖及血管生成等。但G-CSF的作用仍有争议，尚需更多设计更合理的临床研究提供循证医学证据。

2.2.2 宫腔灌注富含血小板血浆（platelet riched plasma，PRP）宫腔灌注PRP是一种试验性干预措施，通过促进组织再生及新血管生成增加子宫内膜厚度。Dieamant等[12]研究纳入33例宫腔灌注PRP或G-CSF治疗的RIF患者，结果显示其种植率、临床妊娠率和自然流产率与33例第一次行IVF/ICSI患者无显著差异，提示PRP的使用可能在一定程度上改善了RIF患者的妊娠结局。另一项回顾性研究对54例RIF患者宫腔灌注PRP治疗后再进行胚胎移植，与自身既往移植周期进行比较，结果显示PRP治疗后患者生化妊娠率（57.4%vs.27.2%）、临床妊娠率（50%vs.9.6%）和活产率（44.4% vs.4.3%）显著提高（均P＜0.01）[13]。但这两项研究中PRP对子宫内膜的影响均无统计学意义。因此，PRP是否能改善子宫内膜厚度尚未可知，治疗RIF的证据依然有限，大多数现有研究受到样本量少、缺乏随机化和对照组的限制，需要更多大样本的随机对照临床研究明确PRP对子宫内膜厚度及妊娠结局的影响。

2.2.3 干细胞治疗干细胞治疗主要是激活休眠细胞和受抑细胞，使这些细胞重新进入细胞周期并增殖。近年来，随着干细胞治疗研究的深入，有证据支持子宫内膜干细胞存在于基底层和功能层中，并且认为在每个月经周期，这些干细胞会对子宫内膜的再生发挥作用，为薄型子宫内膜的治疗带来新希望，但是由于技术的难度及缺乏大样本的研究，目前无法大规模应用于临床实践。2020年Esmaeilzadeh等[14]的研究将子宫内膜间充质干细胞（endometrial mesenchymal stem cell，eMSC）从RIF和非RIF患者的月经血中分离出来，通过聚合酶链反应分析发现，与非RIF患者相比，RIF患者的eMSC中整联蛋白β1低表达，同源框基因A11和整联蛋白β3高表达。其中，同源框基因A11和整联蛋白均为子宫内膜容受性标志物，整联蛋白是一种黏附因子，在子宫内膜表型、胚胎的着床与发育中具有重要意义。由于eMSC存在于高度再生的子宫内膜中，而不存在于相邻的生殖道组织中，表明其可能参与子宫内膜的再生，而整联蛋白β3的表达水平可能是预测ART成功率的有用工具。但仍需进一步研究以确定eMSC中各基因的表达情况，并阐明这些标志物在子宫内膜容受性和妊娠建立中的确切作用，从而制定适宜的RIF治疗策略。

2.2.4 hCG对于薄型子宫内膜的RIF患者在胚胎移植前可以宫腔灌注小剂量hCG改善妊娠结局，可能是通过增加雌激素和孕激素受体在子宫内膜中的表达，从而促进子宫内膜增长，提高内膜容受性。Davar等[15]研究比较了28例薄型子宫内膜患者宫腔灌注hCG前后的子宫内膜厚度，结果显示治疗后子宫内膜厚度显著增加[（7.85±0.52）mm vs.（5.07±0.43）mm，P＜0.001]。另有研究将181例不孕患者1∶1分为hCG组和对照组（无干预），结果显示hCG组的临床妊娠率和活产率虽有提高，但差异无统计学意义[16]。因此，需要更多的随机对照试验来证明hCG对子宫内膜厚度和妊娠结局的改善效果。

2.3 提高子宫内膜容受性子宫内膜容受性是除胚胎因素外对种植率影响最大的因素。评估子宫内膜容受性比较公认的指标是胞饮突。有丰富胞饮突（＞50%）的患者获得临床妊娠的概率也相对较高[17-18]。此外，子宫内膜相关细胞因子在调控子宫内膜容受性方面也发挥了关键作用，它们与细胞表面相应的特异性受体结合，调控受精卵定位及着床。通过检测这些容受性标志物可以评估子宫内膜的种植窗。种植窗可能存在个体差异，称为种植窗偏移，导致子宫内膜形态及组织学虽然完全正常，但胚胎无法着床。

2.3.1 子宫内膜容受性芯片检测个体化调整胚胎移植时间对于因种植窗偏移导致的RIF患者是一个可以尝试的临床策略。Hashimoto等[19]使用子宫内膜容受阵列（endometrial receptivity array，ERA）检测对50例RIF患者进行子宫内膜取样、组织学分析和个性化胚胎移植，结果显示12例（24%）RIF患者出现种植窗偏移，其中10例患者在ERA后接受个性化胚胎移植，38例种植窗未偏移者中有34例接受个性化胚胎移植，最终，种植窗偏移者的种植率（31.6%vs.32.8%）和临床妊娠率（50% vs.58.8%）与种植窗未偏移者相似。值得注意的是出现种植窗偏移者在首次个性化胚胎移植后即获得临床妊娠，表明种植窗偏移可能是该类RIF患者种植失败的关键原因。这也提示一些RIF患者的病因并不是病理状态导致的，而是需要个性化评估以找到理想的胚胎种植时间。Saxtorph等[20]前瞻性队列研究纳入86例RIF患者和37例非RIF第一次行胚胎移植的患者，ERA检测显示49%的RIF患者种植窗偏移，高于非RIF患者（38%），但差异无统计学意义，其对于临床结局的影响仍在进一步随访和验证中。尽管ERA检测可能有助于通过明确种植窗来提高种植率，但是仍需进一步开发及验证干预措施的靶向性及有效性，而不是盲目附加治疗。

2.3.2 子宫内膜搔刮术早在2003年就已经使用子宫内膜轻创来改善胚胎种植结局。既往研究显示，移植前实施子宫内膜搔刮术可通过启动急性炎症反应，导致促进种植的细胞因子和生长因子的释放而有效提高胚胎种植率和临床妊娠率。但Lensen等[21]的一项大型多中心随机对照试验对1 480例第一次移植周期未获得临床妊娠的18～37岁患者随机1∶1分为子宫内膜搔刮术组和常规治疗组，结果显示2组的活产率并无差异。因此，子宫内膜搔刮术在RIF患者中的应用价值仍值得进一步探讨。

2.4 抑制子宫收缩ART过程中，不当的胚胎移植操作及超生理剂量的雌激素可引发频繁的子宫收缩，影响子宫内膜蠕动波，这有可能将移植的胚胎排出子宫腔，还会使子宫内膜血流灌注减少，降低子宫内膜容受性导致RIF。子宫收缩活动由多种生理物质如性激素、神经垂体激素、神经递质、前列腺素和催产素调控。这些物质的表达失调或子宫对这些物质的异常反应可能导致子宫异常收缩，因此越来越受到临床医生的关注。

阿托西班（Atosiban）作为垂体后叶素/血管紧张素Ⅴ1a受体拮抗剂，可抑制子宫收缩，同时减少前列腺素F2α合成，改善子宫内膜及肌层的血流灌注。Ng等[22]随机对照研究纳入800例年龄＜43岁接受IVF/ICSI的患者，结果显示，阿托西班组和安慰剂组的活产率无显著差异。但Lan等[23]前瞻性研究显示，RIF患者使用阿托西班后平均子宫收缩频率较前减少，临床妊娠率可达43.7%。提示阿托西班对改善IVF结局有一定的临床应用前景，但在适应证的把握上仍需临床研究进一步明确。

2.5 改善高凝状态与正常育龄期妇女相比，RIF患者血栓前状态发生率更高。抗磷脂综合征是一种获得性易栓症，以反复动静脉血栓形成、习惯性流产、血小板减少及抗磷脂抗体（antiphospholipid antibody，APL）阳性（中高滴度）为特征。Mahdian等[24]研究比较29例RIF患者和10例健康女性的APL和血小板活化因子水平，结果显示3%的女性APL IgG高于正常水平，仅在RIF患者中观察到β2糖蛋白Ⅰ抗体IgG和抗磷脂酰丝氨酸抗体IgG水平与其他APL（抗心磷脂抗体IgG、抗磷脂酰肌醇抗体IgG）水平呈正相关，而仅在健康女性中观察到抗心磷脂抗体IgG和β2糖蛋白Ⅰ抗体IgG水平与血小板活化因子水平呈负相关；而在RIF患者和健康女性中，抗心磷脂抗体IgM、β2糖蛋白Ⅰ抗体IgM、抗磷脂酰肌醇抗体IgM和抗磷脂酰乙醇胺抗体IgM的水平与其他APL（抗磷脂酰丝氨酸抗体、抗磷脂酰胆碱抗体）IgM水平呈正相关。表明APL的水平会影响自身和血小板活化因子水平，且APL和血小板活化因子在RIF患者及健康女性中可能具有不同的效应，仍需进一步研究探究APL和血小板活化因子的相关性及对妊娠结局的影响。

对易栓症所致的RIF患者采用肝素、低分子肝素、阿司匹林等抗凝药物治疗可以提高胚胎种植率和临床妊娠率。Han等[25]随机对照研究纳入83例患有易栓症的RIF患者，结果显示肝素治疗组（注射低分子肝素）的胚胎种植率（20.9%vs.6.1%）、临床妊娠率（31%vs.9.6%）和活产率（23.8%vs.2.8%）均高于对照组（注射生理盐水，均P＜0.05）。表明低分子肝素是一种安全有效的预防血栓的方法，可以改善存在易栓症RIF患者的妊娠结局。但前提是筛查出真正因易栓症导致RIF的患者，防止药物的过度使用。

2.6 免疫抑制剂治疗胚胎植入过程属于一种半同种异体移植，母体外周血及子宫内膜中的免疫细胞主要包括自然杀伤（natural killer，NK）细胞、巨噬细胞、T细胞和树突状细胞（dendritic cell，DC），它们在种植窗汇集，共同为胚胎着床提供有利的内分泌-免疫微环境。

不同亚群NK细胞对胚胎的作用不同，其中，CD56brightCD16-细胞亚群对胚胎起免疫防护和营养作用。有研究显示RIF患者外周血NK细胞含量明显增加，外周血呈活化状态，细胞毒性增加[26]。Tohma等[27]研究分别使用外周血和宫腔灌洗液来评估RIF患者的免疫状态，在外周血中，RIF患者的NK细胞（CD3-CD16+56+）百分比显著低于非RIF患者（9.8%vs.12.6%，P=0.038），但2组外周血NK细胞的绝对数量相似，差异无统计学意义；在宫腔灌洗液中，RIF患者子宫NK细胞（CD3-CD16dim56bright）百分比显著降低（9.95%vs.12.7%，P=0.026）。提示通过外周血分析NK细胞亚型不适用于RIF患者，更建议使用子宫灌洗液分析。然而目前这些研究仍存在争议，尚需要更多的临床研究评估NK细胞的临床价值。

子宫内膜容受性主要取决于Th1和Th2之间的平衡[27-28]，当这种平衡被打破，将引起免疫耐受失调进而导致RIF。Ghaebi等[29]对40例RIF患者和50例健康女性的T细胞组成和T细胞相关因子的表达进行分析，结果显示RIF患者外周血或子宫内膜表现为Th1/Th2平衡向促炎反应的Th1细胞偏移，Th17/调节性T细胞平衡向Th17细胞偏移。该研究还显示部分RIF患者外周血中髓样DC细胞和浆细胞样DC细胞的数量与比例失衡，过多的髓样DC细胞可促进Th细胞向Th1型分化，进而促进过度炎症反应。针对这些可能存在的免疫因素，临床上也提出了一些干预措施，但尚存有争议。

2.6.1 糖皮质激素治疗长期以来一直认为过度的炎症信号会引起RIF和复发性流产，这导致糖皮质激素的广泛应用，通过恢复子宫内膜的正常免疫以促进胚胎植入。Siristatidis等[30]随机对照研究纳入115例RIF患者，结果显示低分子肝素联合泼尼松龙组的临床妊娠率、自然流产率和活产率与对照组（标准刺激、无辅助治疗）相似，值得注意的是泼尼松龙联合低分子肝素可将RIF患者的临床妊娠率和活产率提高约10%。但美国生殖医学会（American Society for Reproductive Medicine，ASRM）指南中并不建议常规使用糖皮质激素来提高临床妊娠率。糖皮质激素的使用与否及效果仍值得进一步探索。

2.6.2 环孢素A（cyclosporine A，CsA）目前CsA在国内生殖免疫治疗中作为免疫抑制剂广泛应用。为了探究CsA对uRIF患者胚胎移植后妊娠结局的影响，Cheng等[31]分析了146个移植周期，其中CsA组62个周期、对照组84个周期，结果显示CsA组的种植率（51.16%vs.31.97%，P=0.006）、临床妊娠率（58.06%vs.38.10%，P=0.017）和活产率（48.39% vs.32.14%，P=0.047）均有显著提高；特别在非高质量的胚胎中，CsA组种植率（41.38% vs.14.63%，P=0.012）和临床妊娠率（47.62%vs.17.24%，P=0.021）的提高更为显著。提示CsA可以改善uRIF患者的妊娠结局。但是另有研究纳入178例患者的冻融胚胎移植周期，分为CsA组（58例）和对照组（120例），结果显示CsA组的临床妊娠率（63.8% vs.47.5%）和活产率（44.8% vs.38.3%）虽较高，但差异无统计学意义[32]。因此，关于CsA的临床应用需要设计合理、前瞻性的多中心随机对照研究提供更有力的循证医学证据。

2.7 改变胚胎移植方法与新鲜胚胎移植相比，冻融胚胎移植可以提高RIF患者的临床妊娠率和持续妊娠率。Stamenov等[33]提出针对RIF患者采用序贯移植的方法，在冻融移植周期将第3日（D3）卵裂期胚胎和第5日或第6日（D5/D6）囊胚分别进行移植，结果显示D3和D5各移植1枚胚胎的种植率（60.4%vs.39.3%，P=0.03）和临床妊娠率（52.1% vs.30.4%，P=0.05）高于移植2枚D5胚胎，自然流产率降低（6.9%vs.10.7%，P=0.05）。表明序贯移植法有利于改善RIF患者的妊娠结局。将胚胎培养至囊胚期，在一定程度上减少了没有发育潜能及遗传物质异常的胚胎，且缩短胚胎与子宫内膜种植窗的时间差，有利于胚胎着床，改善妊娠结局。种植窗偏移是RIF患者取消周期的主要原因之一，但序贯移植可以弥补这一不足，第一次移植时适当的子宫内膜机械刺激能够提高子宫内膜容受性，更利于第二次移植后的胚胎植入。因此，对于RIF患者，若有足够的胚胎，可以考虑序贯移植方法来提高胚胎种植率和临床妊娠率。

3 结论

目前，对于RIF尚无明确定义，其病因也较为复杂，患者往往多种病因同时存在。关于RIF的影响因素、诊断标准及治疗措施仍在不断深入研究中。但在临床经验中，从“种子”（胚胎）和“土壤”（子宫内膜）两方面来说，“种子”似乎占主要地位，若有充足的整倍体胚胎，妊娠的概率将大大提高。然而，保持健康且功能完整的子宫对于胚胎成功种植也必不可少，宫腔灌注药物已经成为治疗RIF的一个新思路，灌注的时机、剂量、治疗指征及治疗效果还需更多、更严谨的研究加以确定及规范。近年的研究针对不同病因的各项治疗对于胚胎及母体的影响尚无确定、统一的结论，对于妊娠结局的改善也存在争议。未来希望开展更多的动物、细胞实验及多中心的随机对照研究探讨各种治疗方式的效果。