卵巢皮质玻璃化冷冻保存及移植的损伤因素

黄少凤，牛向丽，林忠，朱雪红，宾力，刘姝岑

育龄期患者放化疗及早发性卵巢功能不全女性的生育力保存是临床难点，也是生殖领域的关注热点之一。目前女性生育力保存的方法主要有胚胎冷冻、卵巢组织冻存和卵母细胞冻存，其中胚胎冷冻和卵母细胞冻存均不适用于儿童、未婚女性及可能耽误治疗的癌症患者，且卵母细胞由于冻存耐受性差，常会发生细胞纺锤体、细胞骨架和透明带的损伤，成功率低[1]。而卵巢组织冷冻是有效的女性生育力保存方法，且有利于卵巢功能恢复，但目前尚处于试验阶段[2]。卵巢组织的冷冻方法主要有慢速冷冻法、快速冷冻法、玻璃化冷冻法和定向冷冻法。慢速冷冻法是卵巢组织冷冻的常规方案，目前报道的应用卵巢组织移植技术分娩的婴儿绝大多数是使用此方法[3]。玻璃化冷冻法是组织在高浓度冷冻保护剂下迅速降温，将细胞内外液直接转变为非晶体的玻璃化状态，基本上可避免细胞内冰晶形成对细胞的机械损伤，被认为是目前最有效的卵巢组织冻存方法，且其无需特殊设备，可节约时间及成本[4]。玻璃化冷冻法有望成为卵巢组织慢速冷冻的替代方案。但由于高浓度冷冻保护剂具有细胞毒性，渗透平衡和解冻时的渗透压剧烈变化都会给组织造成损伤，其安全性和有效性尚需进一步验证。

目前卵巢组织冻存和移植的两个重要挑战是：①卵巢组织冷冻损伤及移植过程中的损伤可触发卵泡凋亡，进而引起卵泡发育停滞和闭锁；②卵巢组织移植后缺血再灌注及氧化应激引起的原始卵泡丢失多达50%，因此移植过程中仍然有很多问题需要注意和解决[5]。卵泡损伤是卵巢组织冻存和移植发展的主要限制因素之一。现针对卵巢组织玻璃化冷冻保存过程（冷冻保护剂、卵巢组织大小和冷冻载体）和卵巢皮质片段移植过程（抗氧化剂、促进新血管形成、激素）中的损伤因素进行文献检索，探讨其研究进展，以期能为广大学者和临床工作者提供参考。

1 冷冻损伤的因素

1.1 冷冻保护剂冷冻过程中冷冻保护剂的种类、浓度、冷冻时间、不同卵泡的发育阶段及操作人员技术水平等均与冷冻效果密切相关。冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类，其中渗透性冷冻保护剂包括二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、乙二醇、丙二醇和甘油等，通过渗透细胞起到保护作用，而非渗透性冷冻保护剂包括蔗糖、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖、白蛋白、ε-聚赖氨酸、聚乙二醇和动物血清等[6]。DMSO和乙二醇是目前国际上最常用和最成熟的冷冻保护剂，二者对卵巢组织均具有浓度依赖的毒性作用，渗透性强。当DMSO浓度升高时，其抗氧化特性可转变为促氧化特性[7]。单独使用DMSO可破坏卵泡线粒体、内质网和高尔基体等结构，降低卵泡活力。为降低冷冻保护剂的毒性，优化冻存效果，卵巢组织冻存所用的冷冻保护剂几乎都含渗透性和非渗透性冷冻保护剂，但目前国际尚无统一的最佳配方。相对于各发育阶段的卵泡，原始卵泡对于冻存损伤的抵抗力最强。然而目前卵巢皮质冷冻技术的效果并不是特别理想，冷冻期间卵泡的丢失和受损是玻璃化冷冻法发展过程中需要解决的问题。

目前人卵巢皮质玻璃化冷冻方案常用的冷冻保护剂为DMSO+乙二醇+蔗糖，部分添加白蛋白、血小板裂解物等人血清制品。DMSO、乙二醇、蔗糖的常用浓度分别为10%～20%（V/V）、10%～35%（V/V）和0.1～0.5 mol/L（以0.5 mol/L最常见）[8]。由于原始卵泡约占正常卵巢卵泡总数的90%，其直径为30～80 μm，比生长卵泡直径更小，冷冻保护剂更易浸润，且抗冻能力更强，故目前大多数研究都是针对原始卵泡[9]。在临床中，针对不同类型卵泡采用不同的玻璃化冷冻方案，可尽可能保存女性生育力。

对于生长卵泡比例较高的卵巢组织，使用浓度更高的冷冻保护剂或延长玻璃化冷冻时间可更好地维持细胞内外液玻璃化状态，进而有效维持卵泡正常形态，但冷冻保护剂的毒性也随着浓度增加。如DMSO在低浓度时，可通过降低细胞膜厚度或诱导细胞膜瞬时水孔形成等机制加速细胞液玻璃化；当其浓度＞25%时，可对卵泡细胞膜造成不可逆转地损伤[7]。此外，Gandolfi等[10]研究指出，与丙二醇相比，DMSO保存初级卵泡效果更佳，而保存次级卵泡效果较差。对于次级卵泡比例较多的卵巢组织，可适当提高冷冻保护剂中丙二醇的比例。

总而言之，冷冻保护剂的选择需考虑种类、浓度和卵泡发育阶段等。与单一冷冻保护剂相比，渗透性与非渗透性冷冻保护剂相结合更安全有效。在通过高浓度冷冻保护剂加快细胞液玻璃化状态的同时，应留意子代安全情况。针对卵巢组织中各个发育阶段卵泡的比例不同，进行个体化冷冻可更好地为患者服务，但目前缺乏相应的标准，难以在临床规范化应用。

1.2 卵巢组织大小理论上，冷冻效果与卵巢组织的面积与体积的比值相关，随着其比值的增加，冷冻保护剂可更全面地浸润卵巢组织。Fabbri等[11]已证实卵巢组织的表面积/体积的比值增加确实有利于提高冷冻保存效果。目前大部分研究将卵巢皮质组织处理成厚约1～2 mm，长宽分别为5～8 mm和1～5 mm的片状组织[12]。但是，面积过小的卵巢组织会降低其临床冷冻及移植的意义，因为移植相同体积的卵巢组织，面积小的所需切割次数增加，易引起卵泡破坏或丢失；卵巢组织面积过小，增加冷冻复苏过程和手术操作难度，更易导致卵泡受损；且在植入者体内，缺血再灌注损伤等因素可导致至少50%的卵泡丢失，可使用卵泡减少。此外，若卵巢组织面积过小，其组织结构可能无法充分支持卵泡生长。Zhao等[13]对大面积的人卵巢组织块（大小为18 mm×10 mm×1 mm）经孔洞修剪后进行玻璃化冷冻，获得79.6%的原始卵泡正常形态率和26.1%的卵泡凋亡率，异种移植后新生血管可通过孔洞进入卵巢组织，降低缺血再灌注损伤。因此，大面积卵巢组织经适当孔洞修剪后可保证正常的卵泡结构，且移植后可更快恢复卵巢组织血供，维持其内分泌功能。

此外，若卵巢组织厚度＜1 mm，其冻存及移植效果并未进一步改善。Gavish等[14]将不同厚度（1～2 mm和0.5～0.9 mm）的牛卵巢皮质条带异种移植到小鼠体内，发现降低移植物厚度对新生血管生成并无优势，反而减少原始卵泡和生长卵泡的存活数量。由此可见，对于正常卵巢组织来说，1～2 mm为卵巢组织玻璃化冷冻的最佳厚度。但对于早发性卵巢功能不全患者来说，其原始卵泡和初级卵泡的平均深度（从卵巢皮质表面到卵泡远端的距离）为566 μm，而70%次级卵泡的深度＞1 mm，部分卵泡位于＞1.5 mm的深度，因此该类患者需更加厚的卵巢皮质进行冷冻。Haino等[15]研究指出，随着年龄增长，原始卵泡和初级卵泡移向卵巢皮质更深处，但均距皮质表面＜1mm，仅有部分次级卵泡的深度＞1 mm。临床中玻璃化冷冻方案需尽量个体化，可根据年龄、激素水平[如卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）、黄体生成素（luteinizing hormone，LH）和抗苗勒管激素等]、B超检测卵巢储备功能、是否存在早发性卵巢功能不全、是否接受过性腺毒性治疗、卵巢病理情况（如卵巢皮质纤维化、多囊卵巢综合征、接受睾酮治疗的出生时被指定女性的变性人等）进行评估。

1.3 冷冻载体冷冻载体的选择应考虑降温速率、生物安全性和经济等方面。根据卵巢组织是否直接与液氮接触，可分为封闭式和开放式。封闭式冷冻载体最常用的是冷冻管，卵巢组织不会直接接触液氮，但降温速率较慢。银制封闭式玻璃化冷冻管温度传导性能优越，可迅速降温，更好地保护卵巢组织的发育潜能[16]。开放式冷冻载体包括针浸润载体、电镜铜网、冷冻环、冷冻载杆、金属网条和尼龙网栅等，卵巢组织直接与液氮接触，降温速率快，但可能存在组织污染等风险[17]。虽然有开放式载体玻璃化冷冻的卵巢组织获得健康婴儿的报道，但在临床应用中，由于液氮无法通过紫外线照射、高温等方式消毒，无法隔绝生物污染等风险性，其安全性仍存在很大隐患，不适用于临床。肖准等[18]首创以超细针灸针作载体，最大程度地提高了降温速率，取得了比程序化慢速冷冻和滴入法玻璃化冷冻更佳的冷冻效果。但其循证医学证据仍较少，需进一步探讨。在未来冷冻载体的探讨上，如何尽可能兼顾降温速率与低毒性是主导研究方向。金属中银、金的导热性优于铝、铜，非金属材料中导热性较佳的为碳纤维、石墨、金刚石和氮化钽，或许可从中寻找最佳的冷冻载体材料。载体设计还应考虑通过镂空等方式减少冷冻保护剂残留，进而减少子代安全隐患。

2 移植损伤因素

从2004年Donnez等[19]报道了第1例人类利用卵巢组织冻存和移植获得活产儿后，陆续有利用玻璃化冷冻技术获得活产的案例。2021年孙宁霞等[20]报道了我国首例通过卵泡体外激活联合玻璃化冷冻卵巢组织移植技术成功分娩的案例，经2年随访，小儿体格发育、运动和精神神经发育均正常，进一步验证了卵巢组织冻存和移植的可行性及子代安全性。Donnez等[19]对欧洲五大中心的285例行卵巢组织冻存和移植的妇女进行研究发现，该技术具有显著恢复女性生育功能的潜力。但移植后缺血再灌注损伤及自由基等氧化应激反应引起的原始卵泡丢失是限制女性生育能力恢复的主要因素。由于卵巢组织移植通常采用无血管方式进行，移植时未进行血管吻合，因此移植后卵巢组织会在血运重建前经历数日局部缺血和缺氧期。故血运重建及防止卵泡凋亡是卵巢组织移植物存活的关键。其因素包括抗氧化剂、促进新血管形成和激素等。

2.1 抗氧化剂抗氧化剂可分为非酶类抗氧化剂和酶类抗氧化剂，前者包括维生素C、维生素E、L-半胱氨酸、谷胱甘肽、蛋氨酸、谷氨酰胺、肉碱、麦角硫因、牛磺酸、槲皮素、褪黑素、白藜芦醇、苹果多酚、葡萄籽原花青素及线粒体靶向肽Elamipretie等物质；后者包括谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、辅酶Q10及其衍生物等。杨璐凯等[21]研究表明，低浓度槲皮素（1 μmol/L）可以提高卵巢组织内相关抗氧化酶的水平，可较好保存冷冻卵巢组织的卵泡活性和基质细胞密度，但高浓度槲皮素（10 μmol/L）并不能获得正面效果。白藜芦醇可抑制氧化应激反应保护卵巢，促进冻融后的卵巢组织自体异位移植功能恢复。Wang等[22]也指出，白藜芦醇可通过增加超氧化物歧化酶2、Sirtuin-1、脂质过氧化物和核因子κB含量抑制卵泡凋亡，改善小鼠移植后卵巢组织质量（卵泡形态是否正常、卵泡凋亡情况和移植后卵巢内分泌功能是否恢复）及胚胎结局。褪黑素作为一种抗氧化剂，可以隔离高反应性自由基，中和羟基自由基，其效率高于还原型谷胱甘肽（内源性抗氧化剂）或甘露醇（植物中发现的抗氧化剂），可有效抑制卵泡凋亡[23]。

此外，有学者在冷冻保护剂和复苏液中添加LeIBP（Leucosporidium ice-binding protein）、抗冷冻蛋白Ⅲ等抗冷冻蛋白，其在小鼠、家兔和牛等动物中获得良好效果，可通过与冰晶结合，增加溶液冰点与熔点差值，抑制冰晶生长与重结晶，维持细胞液玻璃化状态，进而有效维持卵泡正常形态，增加卵泡及其周围内皮细胞存活率，而内皮细胞可能参与新血管形成，抑制移植物纤维化[24]。另外，抗冷冻蛋白可能存在抗氧化活性，通过增强超氧化物歧化酶活性抑制卵泡凋亡[25]。但抗冷冻蛋白在人类卵巢玻璃化冷冻保存和移植中的效果尚未得到证实。

1-磷酸鞘氨醇和Z-VAD-FMK等凋亡抑制剂也可能会提高卵巢组织移植的成功率[26]。然而，目前缺乏1-磷酸鞘氨醇和Z-VAD-FMK在卵泡保存和卵巢组织移植成功方面的循证医学证据。此外，卵巢组织冻存和移植过程中凋亡抑制剂最佳给药剂量或给药方法尚未标准化，仍需进一步探索。

2.2 促进新血管形成原始卵泡的代谢需求非常低，其在移植后新生血管形成前相对较长时间缺血的情况下仍能存活。但血管生成速率作为卵泡存活的重要因素，仍是临床亟待解决的关键问题。①血管生长因子，包括纤维母细胞生长因子、转化生长因子和血管内皮生长因子等。血管内皮生长因子可通过酪氨酸激酶受体增加血管募集和功能性血管生成，解除缺氧状态，增加卵泡存活数量及寿命。Kong等[27]研究指出，在异种移植前给予移植部位血管生成素2和血管内皮生长因子预处理可促进血管生成，减轻缺血性损伤，从而维持卵泡的完整性和密度，减少卵泡凋亡和卵巢组织纤维化。血管内皮生长因子的有效性理论上成立，但不可全身或局部大剂量应用。Abir等[28]发现异种移植前将人卵巢移植物在生物胶+维生素E+血管内皮生长因子A中孵化，可抑制卵泡闭锁及基质细胞凋亡，促进Ki-67表达，加快血管生成，减轻缺血性损伤，有利于移植物存活。②1-磷酸鞘氨醇由鞘氨醇激酶催化鞘氨醇磷酸化而成，调节细胞生长和分化等多种细胞增殖过程，促进卵巢移植物中血管生成，减轻组织缺血再灌注损伤[29]。③卵巢移植引起的炎症反应可促使毛细血管再生及纤维细胞增生，形成肉芽组织，进而减少缺血损伤。

2.3 激素在卵巢组织移植过程中，使用促性腺激素可有效促进卵泡存活。FSH与卵泡生长发育密切相关，可提高卵泡存活率，缩短冻融卵巢组织再移植后血流重建时间[30]。陈杰等[31]认为在卵巢玻璃化冷冻全程中添加0.3 IU/mL FSH可抑制活化半胱氨酸蛋白酶3表达，促进颗粒细胞增殖，为健康卵泡生长发育提供充足的营养供给，减少凋亡的发生，维持卵泡的正常形态结构，减少卵母细胞皱缩。而LH在参与卵巢内血管周期性消长的同时，与FSH协同可促进卵巢卵泡的发育及存活，同时LH在抵抗凋亡促进血管发生过程中可提升卵泡对FSH的敏感性，从而促进卵泡生长发育，改善单一FSH刺激形成窦卵泡较少等不足[32]。玻璃化冻存过程添加重组FSH+重组LH的干预模式可增加血管内皮生长因子、缝隙连接蛋白37及两者mRNA的表达，加强卵母细胞与颗粒细胞间营养供给与信息交流，进而改善卵泡存活率，其中以全程干预效果最佳[33]。此外LH作为垂体前叶分泌的促性腺激素，可通过降低卵泡膜细胞的凋亡来保持卵泡激素合成[34]。早发性卵巢功能不全患者对激素受体反应较低，或许增加FSH、LH剂量有利于其卵泡及颗粒细胞生长，降低卵巢组织移植损伤。

3 总结与展望

卵巢组织冻存和移植适用人群广，且是青春期前、需紧急放化疗患者生育力保存的唯一途径，但运用此技术需谨慎评估风险。本文从6个方面阐述了影响卵巢皮质玻璃化冻存及移植损伤的因素，但目前仍无统一的卵巢皮质玻璃化冻存国际标准，且许多研究仍局限于啮齿类、兔、羊和牛等非灵长类动物。卵巢皮质玻璃化冻存的进一步发展有赖于安全有效的卵泡保护方法，如何进一步进行卵泡定位（可根据患者年龄、激素水平、卵巢储备功能、是否存在早发性卵巢功能不全、是否接受过性腺毒性治疗及卵巢病理情况等进行评估）、针对不同发育程度的卵泡进行个体化治疗（根据卵巢组织中各个发育阶段卵泡的比例调整冷冻保护剂种类、浓度、冷冻时间等）、残留的冷冻保护剂对子代发育的毒性、针对大块组织迅速有效的封闭型冷冻载体等均有待进一步研究。此外，卵巢组织冻存中心化（指各医疗机构使用系统的、标准的卵巢组织冻存方案开展工作）还需考虑何种方式更易于临床操作、经济和侵入性操作少等方面，从而进一步推广应用。