非酒精性脂肪性肝病的病理改变及相关分子机制

高静雯 刘晓琳 朱锦舟 许春芳

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是高发的、可进展的慢性肝病，影响全球约25%的人口[1]，7% ～ 30%的NAFLD患者可进展为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，约9%的NASH患者有进展为肝硬化或肝细胞癌的可能[2]，然而目前尚无特效药物用于治疗NAFLD。2020年初，由22个国家30位专家组成的国际专家小组发布的有关代谢相关脂肪性肝病(MAFLD)新定义的国际专家共识声明[3]，将NAFLD更名为MAFLD，提出全面、简便的MAFLD诊断标准，该标准与饮酒量无关，基于肝活检组织学或影像学，甚至血液生物标志物检查提示存在脂肪肝，并满足以下三项条件之一：超重/肥胖、2型糖尿病或者代谢功能障碍[3]。尽管更名后MAFLD的诊断标准已从之前的排他性诊断变为更为积极的肯定性诊断，且不考虑饮酒或合并其他肝脏疾病。但在等待世界范围内接受MAFLD这个新术语和对MAFLD的诊断更加具体前，本文仍沿用NAFLD。基于影像学检查敏感性及可行性较低，且目前尚无血液生物标志物可替代影像学检查，NAFLD的明确诊断仍依赖于肝活检。近年来国内外学者对NAFLD的病理改变进行了大量分子水平的研究，对NAFLD的基础研究、临床诊疗等具有重要意义。

一、正常肝脏组织结构

正常肝脏颜色深红，血液丰富，质地柔软脆弱。肝脏表面覆以富含弹性纤维的致密结缔组织被膜，肝门部的结缔组织伸入肝实质，将实质分成许多肝小叶，肝小叶周围各种管道密集的部位为门管区。肝小叶为肝脏基本结构。中央静脉(CV)位于肝小叶中央，沿其长轴分布，周围肝索和肝血窦呈放射状分布。肝脏中有两种主要的细胞类型：实质细胞和非实质细胞。肝实质细胞(HCs)是肝脏的主要成分，占肝脏总细胞数的60%，占肝脏总体积的80%。它们呈放射状位于肝小叶毛细血管和肝窦之间，含多种细胞器及丰富的化学成分，在能量代谢、解毒和蛋白质合成中发挥关键作用。肝窦细胞为非实质细胞，占肝脏细胞总数的35%、体积的17%，包括肝窦内皮细胞(LSECs)、库普弗细胞(KCs)和肝星状细胞(HSCs)等。LSECs是肝脏中数量仅次于HCs的细胞类型，参与代谢产物运输、炎症和血管生成等生理过程[4]。KCs是肝脏的特化巨噬细胞，也存在于窦状细胞中，参与肝脏损伤的多个病理生理过程[5]。HSCs是位于窦周间隙(space of Disse)的周细胞，被HCs和LSECs包围，分泌层黏连蛋白、蛋白多糖和IV型胶原，形成基底膜[6]，HSCs是肝纤维化的主要细胞类型。NAFLD的发生、发展，是上述细胞结构共同作用的结果。

二、脂肪变性

NAFLD患者多数仅仅表现为单纯性脂肪肝，即中低倍镜下超过5%的肝细胞发生脂肪变性[7]或肝细胞中脂质含量超过5%[8]，而不伴小叶内炎症、气球样变和纤维化(表1)。肝细胞脂肪变性，最简单的定义为肝细胞内堆积充满脂质的空泡，在常规染色的切片上便可看到，外观为清晰透明的圆形结构。肝细胞脂肪变性并非NAFLD独有，也是其他慢性肝病患者最常见的病理表现，因此NAFLD的诊断除了病理表现外，必须结合临床病史。NAFLD的脂肪变性通常是大泡状，有一个大的显性液泡取代细胞核并充满细胞。在疾病的早期阶段，脂肪变的肝细胞通常呈三带分布，首先出现于中央静脉区，汇管区较少[9]。随着脂肪变性的积累，这种带状差别消失，脂肪变性的肝细胞均匀地出现在所有的腺泡区。当肝细胞伴随有许多小液泡的泡沫状，外观可见微泡状脂肪变性，它并非一个突出特征，往往出现于更严重的肝病，由线粒体损伤导致，严重时会危及生命[10]。除常规染色外，肝细胞脂肪变性在油红O染色下呈现红色脂滴，也可以使尼罗红和中性脂质染料在荧光显微镜下分别呈现桔红色和绿色。

NAFLD被认为是代谢综合征的肝脏表现，表现为肥胖、胰岛素抵抗(IR)或2型糖尿病和血脂异常[10]。其病理特征表现为肝脏脂质累积，主要是甘油三酯(TAG)代谢异常，TAG 约60%来源于循环中摄取的非酯化游离脂肪酸(NEFAs)、25% 来自脂质从头合成(DNL)、15%来自饮食[11]。TAG去路主要是以极低密度脂蛋白(VLDL)的形式输出[12]。肝脏通过脂肪酸转运体从外周循环中摄取脂质，脂肪酸转运蛋白和分化簇36参与其中[13]，这些分子受过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)调控。DNL占肝脏脂肪来源的25%[8]，肝脏以乙酰辅酶A为原料合成脂肪酸，关键酶有乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合酶、硬脂酰辅酶 A 去饱和酶，受固醇调控元件结合蛋白1c的调控[14]。脂肪酸β氧化受PPARα调节，氧化过程依赖线粒体、过氧化物酶体和细胞色素，脂质超载情况下会产生大量活性氧(ROS)，促进脂肪性肝炎进展。由于脂肪酸的疏水性，TAG转出依赖水溶性VLDL[15]，VLDL由载脂蛋白B100和酶微粒体甘油三酯转移蛋白组成，该过程还涉及内质网和高尔基体[16]。此外，NAFLD较正常人除了脂质过量累积之外，其脂质组成也有不同，从单纯肝脏脂肪变性或非酒精性脂肪肝(NAFL)到NASH，肝脏中的平均TAG/二酰甘油比值呈逐步上升趋势，游离胆固醇(FC)逐步增加，磷脂酰胆碱(PC)降低，FC/PC比率逐渐增加。NASH中饱和脂肪酸(SFA)/单不饱和脂肪酸(MUFA)+多不饱和脂肪酸(PUFA)比值上升[17]。

NAS为半定量评分系统而非诊断，NAFLD活动度评分(NAFLD activity score，NAS)0～8分，NAS <3分可排除NASH，NAS >4分可诊断NASH，介于两者之间为NASH可能，规定不伴小叶内炎症、气球样变和纤维化但肝脂肪变性> 33%者为NAFL，脂肪变性不到此程度者仅称为肝细胞脂肪变性。

三、脂肪性肝炎

NASH的病理过程包括一系列的代谢紊乱，起于非炎症性的单纯肝脏脂肪变性，以脂肪变性、炎症和肝细胞气球样变为特征，可伴或不伴纤维化[18]。单纯脂肪肝在很大程度上被认为是一种良性疾病，进展风险或临床影响很小，而NASH进展为肝硬化或肝癌的风险较大。单纯脂肪肝与NASH的鉴别诊断在临床实践中具有重要意义，临床试验新药疗效往往以炎症消退为关键结局。

脂肪性肝炎表现为实质炎症和门脉炎症。镜下，实质炎症可见巨噬细胞和淋巴细胞浸润在肝细胞板，伴或不伴少量中性粒细胞。汇管炎症可见门静脉区域内有淋巴细胞和巨噬细胞浸润。此时可以通过标记CD68或F4/80来辅助观察炎症情况[19-20]。除镜下可见的炎症细胞外，参与肝脏炎症反应的还有诸多促炎因子。在脂肪性肝炎小鼠模型中，KCs促进肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和C-C基序趋化因子配体2(CCL2)的产生，参与疾病的早期发生[21]。同时CCL2及受体CCR2参与骨髓单核细胞来源巨噬细胞的招募[22]。KCs分泌的淋巴结样受体蛋白3 (NLRP3)炎性小体，参与炎症和纤维化，其分泌的白介素-1β(IL-1β)，可促进脂肪性肝炎的进展[23]。参与脂肪性肝炎的淋巴细胞由辅助性T淋巴细胞(Th)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和B淋巴细胞组成。Th1分泌的γ-干扰素(IFN-γ)和Th17分泌的白细胞介素-17(IL-17)会加剧炎症和纤维化[24]。细胞毒性CD8+ T细胞，可促进IFN-γ和TNF-α产生，加速脂肪性肝炎的进展，甚至参与到随后的肝细胞癌(HCC)[25]。B2细胞可激活T细胞分泌促炎因子(TNF-α和IL-6)，促进IR和肝纤维化[26]。因此相关炎症因子可作为评估NASH严重程度的生物标记物或探索NASH发病机制的工具。

单凭炎症的严重程度不能帮助区分单纯脂肪肝和脂肪性肝炎，肝细胞气球样变为脂肪性肝炎的特征性细胞病变，也是诊断和评估NAFLD活动程度的必要因素。发生气球样变的肝细胞苏木精-伊红(HE)染色镜下观察比正常肝细胞大，细胞质不规则聚集和滞留，其间有不规则半透明视觉上清晰的间隙。Mallory小体也是脂肪性肝炎的典型病理表现，但不是脂肪性肝炎诊断的必要条件，表现为不规则、密集嗜酸、绳状细胞质内含物，它们与细胞核密切相关，或作为一侧不规则的包涵体，或像项圈一样围绕着细胞核。气球样肝细胞不易找寻，当Mallory小体出现在气球样变肝细胞内时可帮助识别。此外，Mallory小体由角质蛋白8和18(K8/18)[27]过度磷酸化和错误折叠的纤维层组成，而气球样变肝细胞K8/18缺失，泛素和K8/18的双重免疫染色[28]，有助于识别Mallory小体和气球样变肝细胞。

四、纤维化

与其他慢性肝病类似，脂肪性肝炎或单纯脂肪肝患者也会发生肝纤维化，甚至在发现脂肪性肝炎时，已存在一定程度的纤维化。多数研究表明，纤维化是肝脏相关死亡率的主要因素[29]。不同于慢性病毒性肝炎和胆汁淤积性肝炎，NASH纤维化始于中央静脉区而非门脉区。胶原沉积于HCs和LSECs之间的窦周间隙，形成纤维网络，包围并隔离了从末端肝小静脉延伸出来的单个HC[10]。纤维化早期可以借助特殊染色观察，如Masson染色、天狼星红染色、van Gieson染色和reticulin染色，α-SMA免疫染色，或者测定肝组织中羟脯氨酸、胶原蛋白含量来判断有无肝纤维化发生。随着纤维化进展，纤维网格增厚和肝细胞消失，其次门脉周围纤维化、门脉周围肝细胞被胶原纤维包裹，接着桥接纤维化，从门脉区到邻近的终肝小静脉，沿中央静脉区纤维性连接，甚至发生肝硬化，此时常规染色便可观察到[10](表2)。研究发现，胆管损伤也会促进肝脏纤维化进展，此时K7和 K9的免疫染色有助于观察胆管损伤[30]。

NAFL发展为NASH和纤维化与一系列肝脏损伤有关，这些损伤由脂肪毒性、氧化应激、一氧化氮、内质网应激、炎症和凋亡引起，并依次发生在不同的肝脏细胞中，最终导致肝脏再生和纤维化的激活，胶原蛋白增多和细胞外基质(ECM)沉积，促进肝纤维化和肝硬化。肝转化生长因子-β (TGF-β)是最有效的纤维化细胞因子，是HSCs激活和肝纤维化的关键驱动因子[29]。此外，HCs和KCs等细胞及其相关的细胞因子，也参与肝脏纤维化的进展。

五、其他病理表现

NAFLD患者的肝脏活检中还可以看到巨线粒体、胞质糖原病、糖原核、脂肪肉芽肿和铁沉积等。其中，糖原性肝细胞病需要注意，因为糖原性肝细胞很常见，可以模仿气球样变肝细胞或使其难以识别。在糖原病中，肝细胞弥漫增大，呈苍白色，胞浆稀少，细胞膜突出。糖原性肝病是一种急性形式的糖原病，与1型糖尿病和高转氨酶水平有关，一旦血糖水平控制住即可消失[31]。在NAFLD均可见巨线粒体，它们是卵球形嗜酸性、高碘酸-希夫反应阴性的细胞质内含物[32]。糖原核是NAFLD和NASH中常见的发现，并与糖尿病相关[10]。脂肪肉芽肿可见于NAFLD和其他慢性肝病，由于它们可能位于终末肝小静脉附近，并与纤维化有关，因此在疾病早期可引起混淆，在评估NAFLD纤维化时，应考虑与脂肪肉芽肿相关的纤维化。约1/3的NAFLD患者表现出铁超载的迹象，Nelson等[33]在849例患者的队列研究中发现铁沉积与NAFLD组织学严重程度相关。铁超载、脂质过氧化等引起铁死亡，铁死亡抑制剂，包括铁抑素-1、自由基捕获抗氧化剂和脂蛋白抑素-1，能够缓解NAFLD动物模型的炎症、纤维形成和肝损伤[34]，普鲁士蓝染色可以通过简单的半定量评分来评估肝铁素沉着[35]。虽然目前这些表现在NAFLD的诊断中不充分也不必要，但有助于全面了解NAFLD的发病机制。

正确且充分地认识NAFLD的病理特征及背后的分子机制，是研究、诊断、治疗疾病的理论基础，相信在日新月异的科技发展中，对NAFLD的诊断会更加准确，对NAFLD的防治会更加科学合理。