载雷公藤内酯醇靶向超声微泡的制备及对乳腺癌细胞增殖抑制的初步研究

陈子合 黄健 黄春鑫 刘慧临

乳腺癌(breast cancer)是女性发病率最高的恶性肿瘤,全球乳腺癌新发病例约230 万,在全部新发恶性肿瘤中占比11.7%,乳腺癌发病率已经超过肺癌,成为最常见的癌症［1］。目前国内常用的治疗方式是联合治疗［2］,但预后仍然不尽人意,部分患者死于肿瘤复发或远处转移。雷公藤内酯醇(triptolide,TPL)是一种天然成分,来源于中药雷公藤的根［3］,其具有多种作用,包括抗炎、抗氧化、抗癌等。对于癌症治疗,雷公藤内酯醇已经被证实可以显著抑制乳腺癌的生长,治疗乳腺癌效果良好［4］。由于雷公藤内酯醇在水中溶解性低以及对人体胃肠道、造血系统等毒性较大［5］,使其在临床应用上受到了较大的限制。而超声分子影像技术的出现,则为临床提供了更高效诊断、治疗的新技术和方向。超声微泡能够协载输送药物,克服了药物的低水溶性,并且还能够减少药物对于正常组织器官的毒副作用［6］。既往研究发现,乳腺癌MCF-7 细胞表面有大量的叶酸受体表达［7］,而叶酸能够特异性地与叶酸受体结合,因此利用超声微泡协载成像物质与其连接,可以在分子和细胞水平上靶向监测乳腺癌的分布范围和位置,通过超声靶向击碎技术,能够定点释放协载药物,做到精准治疗。因此本研究旨在制备一款协载雷公藤内酯醇靶向于人乳腺癌MCF-7 细胞的超声微泡(FA-TLLM),评价其表征并对乳腺癌细胞增殖抑制作用进行初步研究。

1 材料与方法

1.1实验材料与主要仪器

1.1.1实验材料 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DPPC,上海麦克林生化科技有限公司)、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇2000-叶酸(DSPEPEG2000-Folate,重庆渝偲医药科技有限公司)、雷公藤内酯醇(上海源叶生物科技有限公司)、全氟丙烷(C3F8,天津核工业理化工程研究院)、叶酸单克隆抗体、FITC 标记的兔抗鼠免疫球蛋白G(IgG)(上海艾比玛特生物医药有限公司)、人乳腺癌MCF-7 细胞(中国科学院上海细胞库)、Cell Counting Kit-8(上海陶术生物科技有限公司)

1.1.2主要仪器 真空旋转蒸发仪(瑞士BUCHI)、银汞调和机(上海医疗器械公司)、倒置荧光显微镜(德国Zeiss)、流式细胞仪(美国BD)、激光粒径测定仪(美国PSS)、酶标仪(澳大利亚Tecan)、便携式超声诊断仪(荷兰Philips)

1.2实验方法

1.2.1FA-TLUM 的合成 采用薄膜水化法将DPPC 5 mg、DSPE-PEG-FA 2 mg、雷公藤内酯醇1 mg 完全溶解于10 ml 三氯甲烷中,通过旋蒸形成脂质薄膜。加入4 ml PBS 水化后通入全氟丙烷气体,置于银汞调和机上机械震荡 40 s,静置后弃去上层泡沫得到FATLUM。

1.2.2FA-TLUM 的表征检测 通过倒置显微镜观察FA-TLUM 的一般形态,激光粒径测定仪检测FATLUM 水合粒径、Zeta 电位。

1.2.3载药量及包封率的测定 通过紫外分光光度法测定FA-TLUM 中雷公藤内酯醇的载药量及包封率,用甲醇溶解雷公藤内酯醇并分别配置成不同浓度梯度的样品溶液,测量各浓度溶液在218 nm 的OD 值,根据浓度和OD 值,利用Origin 软件绘制拟合标准曲线。低速离心FA-TLUM,甲醇溶解上层泡沫和底部沉淀,测定OD 值,结合拟合标准曲线计算载药量和包封率。载药量=(总投放量-游离量/微泡总质量)×100%；包封率=(总投放量-游离量/总投放量)×100%。

1.2.4FA-TLUM 表面叶酸连接情况的鉴定 分别量取0.5 ml 载雷公藤内酯醇非靶向超声微泡(TLUM)及FA-TLUM 于Ependoff 管中,加入2 μl 叶酸单克隆抗体,置于冰箱4℃孵育过夜。低速离心(800 r/min,3 min),PBS 清洗3 次以去除过量的一抗。加入1 μl FITC 标记的兔抗鼠IgG 二抗,室温避光孵育1 h。低速离心,PBS清洗3 次去除过量的二抗。取出稀释后置于倒置荧光显微镜观察,并于流式细胞仪检测FA-TLUM 加入一抗前后的荧光强度。

1.2.5FA-TLUM 体外针对人乳腺癌MCF-7 细胞寻靶能力的检测 取对数生长期的MCF-7 细胞,按1×105个/孔接种于六孔板内,继续培养24 h,制备MCF-7 细胞爬片。分别量取100 μl TLUM 及FA-TLUM加入到六孔板内,每孔加入2 ml 培养液,继续培养30 min。取出爬片,PBS 反复冲洗3 次。最后将细胞爬片浸泡于新的培养液内,倒置显微镜观察结合情况。

1.2.6CCK-8 法检测MCF-7 细胞毒性作用 实验分为7 组,每组设6 个复孔：空白对照组(Con 组)、雷公藤内酯醇组(TPL 组)、雷公藤内酯醇联合超声组(TPL+US 组)、载药微泡组(TLUM 组)、载药微泡联合超声组(TLUM+US 组)、叶酸修饰的靶向载药微泡组(FA-TLUM 组)、叶酸修饰的靶向载药微泡联合超声组(FA-TLUM+US 组)。取对数生长期的MCF-7 细胞,按8000 个/孔接种于96 孔培养板,每孔接种体积100 μl。空白对照组给予常规培养液处理,给药组以TPL IC50［8］的药物浓度(20 nmol/L)给药,超声辐射机械指数MI=1,辐照时间1 min。继续培养48 h,每孔加入10 μl CCK-8试剂,37 ℃培养箱中孵育2 h,用酶标仪在450 nm 测定A 值。

1.3统计学方法 采用SPSS26.0 统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差()表示,t 检验或单因素方差分析进行两组或多组间比较。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1FA-TLUM 的表征检测结果 倒置显微镜下观察微泡大小均一,分布均匀,彼此无明显聚集。FA-TLUM 平均水动力尺寸为(1.36±0.03)μm,Zeta 电位为(-16.55±0.36)mV。见图1,图2。

图1 FA-TLUM 水合粒径图

图2 FA-TLUM Zeta 电位图

2.2FA-TLUM 载药量和包封率的测定结果 实验测定不同雷公藤内酯醇浓度的吸光度,用Origin 进行线性拟合后,相关性R2=0.99873,呈现出良好的线性关系。通过计算得出FA-TLUM 载药量为(10.85±0.48)%,包封率为(75.94±3.36)%。见图3,图4。

图3 不同波长下TPL 吸光度曲线

图4 微泡数据经线性拟合函数图像

2.3FA-TLUM 表面叶酸连接情况的鉴定结果 在倒置荧光显微镜下观察发现TLUM 周围未见绿色荧光,而FA-TLUM 周围可见明显绿色荧光分布。说明FATLUM 表面有叶酸连接,通过流式细胞仪进行半定量分析,加入一抗、二抗孵育后较孵育前荧光强度增加,可进一步验证微泡表面有大量叶酸连接。见图5,图6。

图5 倒置荧光显微镜下观察 TLUM 和 FA-TLUM 表面叶酸连接情况TLUM(图 a、b)、FA-TLUM(图 c、d)

图6 流式细胞仪检测FITC 标记FA-TLUM

2.4FA-TLUM 体外针对MCF-7 细胞的寻靶能力检测结果 通过倒置荧光显微镜观察发现FA-TLUM 与MCF-7 细胞连接牢固,主要分布于细胞周围,而TLUM未见或仅见极少量与MCF-7 细胞粘附。见图7。

图7 倒置荧光显微镜下观察 TLUM 和 FA-TLUM 体外寻靶能力TLUM(图 a)、FA-TLUM(图 b)

2.5CCK-8 法检测MCF-7 细胞毒性作用结果 检测结果表明,TPL 组、TPL+US 组、TLUM+US 组、FATLUM+US 组对MCF-7 细胞增殖具有明显的细胞毒性作用,差异具有统计学意义 (P＜0.05),四组中可以明显看到FA-TLUM+US 组的细胞毒性作用强于其他3 组,差异具有统计学意义 (P＜0.05)；TLUM 组、FA-TLUM 组和Con 组间比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。见图8。

图8 CCK-8 法检测各处理组对MCF-7 细胞的毒性作用

3 讨论

癌症已经严重危害人类生命健康和社会发展进步,乳腺癌正是全球发病率最高的恶性肿瘤,死亡率居世界第5 位［9］,提升乳腺癌的治疗效果是亟待解决的问题。

近年来,中药抗肿瘤受到极大关注,因其治疗效果良好且副作用小,逐渐成为抗肿瘤领域的研究热点。既往已有研究表明,雷公藤内酯醇具有广谱、高效的抗肿瘤特点,对多种乳腺癌细胞增殖抑制作用明显,对人乳腺癌MCF-7 细胞尤其敏感［10］。但是雷公藤内酯醇水溶性差,毒性作用大亟待解决。Zheng 等［11］将阳离子脂质体作为载体包裹雷公藤内酯醇,通过修饰HA介导脂质体靶向乳腺癌细胞高表达的CD44 受体,避免雷公藤内酯醇与体液直接接触,降低对人体的刺激性以及生物毒性。Luo 等［12］将雷公藤内酯醇包裹在新型温度响应型聚(N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸)-泊洛沙姆F68 水凝胶,显著降低雷公藤内酯醇毒性作用。目前还鲜有研究将雷公藤内酯醇与超声微泡相结合,本实验利用脂质体为载体,雷公藤内酯醇负载在磷脂双分子层内,改善雷公藤内酯醇低水溶性,全氟丙烷作为承载物,能够通过超声设备进行二次谐波成像,实时监测微泡分布范围和位置且微泡具有较低细胞毒性。本实验制备的微泡大部分在1～2 μm 之间,分布均匀,电位-16.55 mV 左右,稳定性较好,载药量和包封率符合预期要求。

近年来,药物靶向输送逐渐成为研究领域热点,叶酸受体在乳腺恶性肿瘤过表达,在正常组织表达高度保守,并且其过表达与预后不良相关［13］。叶酸是一种天然小分子物质,相比于大分子物质,到达靶点时间短,穿透能力极强,免疫反应小,易于修饰,叶酸与叶酸受体结合具有高度亲和力,因此叶酸和叶酸受体在靶向输送中有着巨大的潜力［14］。免疫荧光实验显示,叶酸被成功连接到微泡表面,流式半定量进一步分析,相比加入一抗之前微泡荧光强度显著提高,说明大量的叶酸被成功偶联。体外寻靶实验显示,微泡可以主动结合到人乳腺癌MCF-7 细胞,并且在经过PBS 3 次反复冲洗下还能够结合到细胞表面,说明寻靶能力较好。CCK-8 实验结果显示,相比于仅使用雷公藤内酯醇或TLUM+US,FA-TLUM+US 对于MCF-7 细胞的增殖抑制作用更强,抗肿瘤能力更强,因此FA-TLUM 联合超声靶向破碎技术有望为临床治疗乳腺癌提供新的研究思路。而没有超声靶向破碎技术参与的组别,与CON 组比较差异无统计学意义(P＞0.05),这说明FATLUM 发挥作用与超声靶向破碎技术密不可分,分析原因可能与微泡被超声击碎时内部气体瞬间产生空化效应有关［15］。本研究目前在细胞水平对MCF-7 细胞毒性作用进行初步探讨,为后续研究MCF-7 细胞凋亡机制以及动物实验奠定了基础,以期将来能够应用于临床诊断与治疗。

综上所述,本研究成功制备载FA-TLUM,且FATLUM 与超声靶向破碎技术联合能够增强对人乳腺癌MCF-7 细胞的增殖抑制作用。