小细胞肺癌中SASH1 蛋白的表达情况及其与E-钙黏蛋白表达的相关性分析

张晓丽 张晓红 刘宇 沈方臻

据统计,2020 年全球肺癌新增病例数达220 万例,约占癌症确诊病例的11.4%,目前是癌症死亡的主要原因［1］。小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)约占肺癌的15%,恶性程度高,预后差［2］。目前研究发现,SCLC 是上皮间充质转化(EMT)样癌症,可表现为癌细胞中E-钙黏蛋白表达减少［3］。E-钙黏蛋白是连接上皮细胞的重要标志蛋白,能够维持细胞之间的极性状态,被称为典型的肿瘤抑制因子［4］。其与N-钙黏蛋白以及波状蛋白作为EMT 过程中主要的蛋白标志物,可介入到多种恶性肿瘤的侵袭、扩散、转移的过程中。2003 年Zeller 等［5］研究乳腺癌细胞杂交性丢失时,发现一种新的抑癌基因——SASH1 基因。随着近年来对SASH1 蛋白的深入研究发现,SASH1 蛋白参与多条信号转导过程,其表达的减少或缺失与晚期恶性肿瘤的发生密切相关,如肝癌［6］、卵巢癌［7］等。同时,在多种恶性肿瘤中发现,SASH1 蛋白与EMT 之间有一定的关联性,如结肠癌［8］及肝癌［6］等。但在SCLC 中研究较少,本研究选取E-钙黏蛋白作为EMT 的标志物,就SCLC 中SASH1 蛋白的表达情况及其与E-钙黏蛋白表达的相关性展开探讨。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2009 年1 月～2018 年12 月在临沂市肿瘤医院经过术后组织病理诊断为SCLC 的石蜡标本50 例。患者术前均未进行抗肿瘤治疗(如放化疗),未合并其他恶性肿瘤,不伴有严重的基础疾病。其中男40 例,女10 例；年龄43～77 岁,平均年龄(56.42±9.47)岁；32 例＜60 岁,18 例≥60 岁；有淋巴结转移38 例,无淋巴结转移12 例；术后病理TNM 分期：Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期分别为10、21、19 例。此研究获得本院伦理委员会同意。病例信息在本院联众病案数据系统中收集。

1.2免疫组化方法 所有手术标本固定在福尔马林中,石蜡包埋,将蜡块进行切片(厚度4 μm),之后经过脱蜡、水化处理,柠檬酸盐溶液进行抗原修复,冷却至室温,之后内源性过氧化物酶活性应用3% H2O2阻断,并采用10%山羊血清封闭,抗SASH1 多克隆抗体(abcam,ab111901)、E-钙黏蛋白(中杉金桥,ZM0092)孵育,4℃过夜。之后用辣根过氧化物酶标记山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G 抗体(中杉金桥,ZB2301)孵育,二氨基联苯胺(DAB)显色。细胞核采用苏木精-伊红(HE)染色,持续1 min,然后开始脱水、透明、封片、风干过程。实验过程中选择PBS 缓冲液取代一抗作为空白对照。

1.3染色结果判定标准 由两名经验丰富的病理医师进行评估,采用双盲法,并在100、200、400 倍显微镜下观察图像,做出评判。SASH1 蛋白、E-钙黏蛋白表达的判定标准主要分为以下2 个部分：①染色强度水平的测定。染色强度分级：0 分：无明显染色；1 分：浅黄色；2 分：棕黄色；3 分：棕褐色。②阳性细胞百分比计分。SASH1 蛋白判定标准：0 分：阴性；1 分：＜10%；2 分：10%～50%；3 分：51%～74%；4 分：≥75%。E-钙黏蛋白判定标准：0 分：＜5%；1 分：5～25%；2 分：26%～50%；3 分：51%～75%；4 分：＞75%。每张切片都经过以上两项评定后,两数值相乘。SASH1 蛋白：阴性：＜3 分；阳性：≥3 分。E-钙黏蛋白：阴性：≤3 分；阳性：＞3 分。

1.4观察指标 ①SCLC 癌及癌旁组织中SASH1 蛋白和E-钙黏蛋白的表达情况；②SCLC 癌组织中SASH1蛋白表达的影响因素；③SCLC 癌组织中SASH1 蛋白、E-钙黏蛋白表达的相关性。

1.5统计学方法 采用SPSS20.0 统计学软件进行统计分析。计数资料以率(%)表示,采用χ2检验；相关性检验采用Spearman 相关分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1SCLC 癌及癌旁组织中SASH1 蛋白、E-钙黏蛋白表达情况 ①SCLC 癌及癌旁组织HE 染色结果。见图1。②在光学显微镜下观察发现,SASH1 蛋白主要在SCLC 癌及癌旁组织的细胞质中表达,在部分细胞核中亦可见表达；E-钙黏蛋白主要在SCLC 癌及癌旁组织的细胞膜中表达。见图2。③SCLC 癌组织中SASH1蛋白、E-钙黏蛋白的阳性表达率分别为44.00%、48.00%,均低于癌旁组织的74.00%、80.00%,差异有统计学意义(χ2=9.301、11.111,P=0.002、0.001＜0.05)。见表1。

表1 SCLC 癌组织及癌旁组织中SASH1 蛋白、E-钙黏蛋白的表达情况比较［n(%)］

图1 SCLC 癌组织及癌旁组织HE 染色结果

图2 SCLC 癌旁组织及癌组织中SASH1 蛋白、E-钙黏蛋白的表达

2.2SCLC 癌组织中SASH1 蛋白表达的影响因素SCLC 伴有淋巴结转移的SASH1 蛋白阳性表达率为34.21%,不伴有淋巴结转移的SASH1 蛋白阳性表达率为75.00%,差异有统计学意义(P＜0.05)；SASH1 蛋白在SCLC 不同TNM 分期(Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期)中的阳性表达率比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 SCLC 癌组织中SASH1 蛋白表达的影响因素［n(%)］

2.3SCLC 癌组织中SASH1 蛋白、E-钙黏蛋白表达的相关性分析 经Spearman 相关性分析,SCLC 癌组织中SASH1 蛋白表达水平与E-钙黏蛋白表达水平呈正相关(r=0.519,P＜0.05)。见表3。

表3 SCLC 癌组织中SASH1 蛋白、E-钙黏蛋白表达的相关性分析

3 讨论

SCLC 初诊时＞70%的患者已出现远处转移,使得近20 多年来SCLC 患者的5 年生存率未能发生明显变化［9］。SASH1 蛋白在多种恶性肿瘤中已有研究,并发现其可能通过EMT 过程来调控肿瘤的发生发展。但在SCLC 中研究较少,本研究对此进行探讨。

SASH1 基因包含不育-α-基序(SAM)结构域和鸡肉瘤病毒同源3(SH3) 结构域［5］。近年来研究发现,SASH1 介入多种信号转导途径,调控肿瘤细胞的增殖、侵袭及凋亡等过程。本研究观察到SCLC 患者SASH1蛋白在癌组织中表达较正常组织呈现减弱现象,并且肿瘤分期越晚、存在淋巴结转移的,其表达水平越趋减低,提示SASH1 蛋白表达水平高低可能与恶性肿瘤侵袭转移情况有关,这与SASH1 基因可能为抑癌基因的推论相吻合。Martini 等［10］发现SASH1 可以与肌动蛋白细胞骨架相互作用,刺激细胞基质粘附,当SASH1 蛋白表达减少时,势必会导致细胞基质粘附减少,促进迁移的发生。EMT 是指在恶性肿瘤转移开始时,肿瘤细胞激活原发肿瘤内潜在的胚胎程序,上皮细胞失去粘附连接和上皮极性,并获得具有侵袭性的间充质表型,是癌症死亡的主要原因。在EMT 过程中,一小部分癌细胞获得了干细胞特性(CSCs),这促进了肿瘤的长期增殖、耐药性和转移［11,12］。间充质细胞标志物 N-钙黏蛋白(N-cadherin) 和波形蛋白(vimentin)表达增加,而上皮细胞的特色标志物E-钙黏蛋白减少,这是EMT 的最具代表性的检测手段［13-15］。本研究中,SCLC 癌组织中E-钙黏蛋白的表达较癌旁组织相比呈现减弱趋势,这符合E-钙黏蛋白的分子生物学基础。张宇靖等［16］发现子宫内膜癌癌组织中E-钙黏蛋白呈现低表达状态,其表达水平较正常子宫内膜组织中明显降低,并提出E-钙黏蛋白表达下调能够减弱肿瘤细胞间的粘附作用。本研究发现,SASH1 蛋白、E-钙黏蛋白在SCLC 中表达呈现正相关。目前多项研究证明,SASH1 基因可通过影响EMT 的过程来调节肿瘤的发生发展。He 等［6］在肝癌研究中发现,转染pcDNA3.1-SASH1 后的HepG2 和HCCLM3 细胞中E-钙黏蛋白的表达水平较对照组呈现升高趋势,而在HepG2 中过表达SASH1 后,波状蛋白和N-钙黏蛋白的表达水平较对照组明显减低趋势。基于上述研究结果,SASH1参与肝细胞癌(HCC)细胞的增殖和侵袭,而这主要通过EMT 过程来调节。Franke 等［8］在结直肠癌中研究发现,SASH1 与信号适配器CRKL 之间存在一定的关联性,可抑制结直肠癌EMT 过程,进而抑制肿瘤的发生和转移。

SCLC T1～2N0M0者手术能明显获益。本研究所选定病例中,存在Ⅱ期及Ⅲ期的患者,分析原因有：①一些病例没有明确的术前病理诊断,属于非计划外科手术,术后病理确定为SCLC；②临床分期T1～2N0M0的SCLC患者,术后病理存在淋巴结转移。本研究的优点是选用了手术大标本,降低了因活检小标本导致的肿瘤异质性所引起的误差。缺点是SCLC 早期发现能手术切除的病例较少,导致样本量偏少。在后期的研究中,将进行体外细胞实验,从基因层面分析SASH1 在SCLC发生发展中的作用,深入探索与SASH1 基因相互作用的分子及作用机制,为SCLC 的诊断与精准治疗提供新的思路。