肌萎缩侧索硬化中RNA结合蛋白相关突变研究进展

杨芳 朱瑜 何佩 徐仁伵

(1江西省人民医院神经内科，江西 南昌 330006；2南昌大学医学部研究生院)

肌萎缩侧索硬化(ALS)是一种进行性、致命性的神经退行性疾病，其特征为选择性侵犯脑与脊髓运动神经元，现有研究发现神经胶质细胞等也存在受累。ALS病因尚不十分明确，其已发现的致病机制具有多样性、异质性，因此仅利鲁唑和依达拉奉能轻度延缓疾病发展且未发现其他特异性药物治疗此疾病。ALS通常发病在中老年时期(平均年龄55岁)，平均生存期3～5年，少数患者可带病生存。随着生物分子技术的不断发展，愈来愈多的分子机制被发现，其中RNA结合蛋白(RBPs)占据重要地位。本文对ALS中RBPs相关突变的作用及机制的研究进展进行综述。

1 RBPs

RBPs可以结合单链或者双链 RNAs，对调节转录后基因的表达和组织特异性可变剪接有重要作用。RBPs 参与RNA的转录、编辑、剪接、运输和定位、稳定性与翻译等生物学过程〔1〕。RBP伴随RNA生命始终，一个RBP可能存在多种靶标RNA，且其表达缺陷会造成多种疾病。人体内5%～10%的蛋白质可与RNA结合，到目前为止，研究人员尚未对所有RBPs进行普查，已知的RBPs数量仍是估计数。基于现有研究，尚认为哺乳动物细胞存在1 000～2 000个RBPs。有研究者指出，致力于发现新的RBPs意义可能并不大，更重要的事情在于探究RBPs的调节和生理功能〔2〕。有研究使用IBM Watson人工智能算法对RBPs进行筛选和排序，通过结合免疫组织化学处理来自ALS和非神经疾病对照组织的蛋白质及多功能干细胞分化而来的运动神经元的RNA分析，验证了ALS潜在改变的前10位候选RBPs〔3〕，即异质核核糖核蛋白(hnRNP)U、突触蛋白结合细胞质RNA相互作用蛋白(Syncrip)、RNA结合基序蛋白(RBM)45、RNA结合基序单链相互作用蛋白(RBMS)3、丝氨酸/精氨酸丰富剪接因子(SRSF)2、hnRNPH2、类核蛋白(NUPL)2、细胞周期相关蛋白(CAPRIN)1、RBM6、甲烯基四氢叶酸合成酶结构域蛋白(MTHFSD)。目前研究发现基因表达中转运和翻译过程是相互联系的，如果蛋白质合成要发生在不同的亚细胞器中，mRNA必须在转录后不久就被识别出来，并在转运到适当空间的过程中处于翻译休眠状态。RBPs既可抑制转录后的翻译，也可激活此过程，此机制归因于RBPs zipcode结合蛋白(ZBP)1。ZBP1通过阻断翻译起始来阻止细胞质中的过早翻译，只有当ZBP1-RNA复合物到达细胞外围的目的地时，才会发生翻译。在mRNA转运的终点，蛋白激酶Src通过磷酸化ZBP1中与RNA结合所需的关键部位酪氨酸残基来促进翻译〔4〕。

2 ALS的发病机制

虽然目前ALS病因尚不明确，但其可能的发病机制已被初步描述，或与遗传因素、兴奋性氨基酸毒性、氧化损伤、神经营养因子缺乏、线粒体功能缺陷、蛋白质的异常聚集、轴突运输损害等密切相关，且其作用可相互重叠，相互影响。

从第一个经典蛋白超氧化物歧化酶(SOD)1基因突变被发现〔5〕，至今已有20多种蛋白〔6〕明确其功能改变、分布改变、错误定位以及异常聚集都影响ALS的病程。其他ALS基因的致病突变，包括TAR DBP、TARDNA结合蛋白(TDP)-43、FUS、hnRNPA1、选择性自噬接头蛋白(SQSTM)1、缬酪肽蛋白(VCP)、视神经蛋白(OPTN)和抑丝蛋白(PFN)1等，也在散发ALS患者中被发现，尽管它们很罕见。遗传变异增强了ALS的易感性，或改变其临床表型〔7〕。已经证明SOD1突变体的致病性是由于毒性功能的获得而不是正常功能的丧失，SOD1的错误折叠及积聚诱导内质网应激，形成氧化损伤〔8〕。有研究提出了一种新的TDP-43毒性机制，其中TDP-43存在于线粒体中，通过优先结合线粒体转录的Nd3/6mRNAs，并通过抑制其翻译引起线粒体功能障碍和神经退行性损伤〔9〕。编码微管调节器的微管解聚蛋白(STMN)2在TDP-43基因敲除和TDP-43基因错误定位动物模型中及ALS患者脊髓尸检中表达下降。STMN2对于正常的轴突生长和再生是必不可少的。在TDP-43基因敲除模型中，STMN2下调是由于RNA剪接错误造成的，STMN2翻译后的稳定性可挽救了TDP-43缺失引起的神经突生长和轴突再生缺陷〔10〕。现在已经提出了几种基于FUS介导的毒性机制，包括突变体FUS聚集和重新分布到细胞质中。FUS包涵体的形态和分布在不同神经退行性疾病的中枢神经系统(CNS)中不同，据报道FUS包涵体在亨廷顿病中是存在细胞核，但主要是在ALS和额颞叶变性(FTLD)中的细胞质〔11〕。

3 与ALS相关的RBPs

研究发现11个RBPs的基因突变或变异体与ALS相关，包括TARDBP、FUS、hnRNPA1、hnRNP A2/B1、细胞核基质蛋白Matrin(MATR)3、神经退行性疾病相关解旋酶Senataxin(SETX)、延伸体乙酰转移酶复合体亚基(ELP)3、真核细胞RNA结合蛋白Atarin(ATXN)2、血管生成素(ANG)、运动神经元存活基因(SMN)1和SMN2〔7、12、13〕。此外，在ALS患者的神经元和(或)胶质细胞中，发现许多其他RBPs表现出亚细胞分布的改变，但并无引起ALS的已知突变〔14〕，这表明即使RBPs的基因未发生突变，也能引起ALS中RNA稳态的破坏，或是在ALS的发生发展过程中影响RNA的代谢及稳定。

3.1hnRNPA1 hnRNP A1是hnRNP家族成族成员。hnRNP家族是能与新生mRNA结合的一组相关蛋白〔15〕。参与将pre-mRNA包装到hnRNP颗粒中，将polyA mRNA从细胞核转运到细胞质，并可能调节剪接位点选择。小RNA干扰消耗RBPs Sam68会引起抗凋亡B细胞淋巴瘤(Bcl)-x积累，而其上调会增加促凋亡Bcl-x水平；hnRNP A1和Sam68协同调节活细胞中Bcl-x的选择性剪接和细胞凋亡〔16〕。亚细胞无膜细胞器由具有低复杂性结构域的蛋白质组成。它们中的大部分如hnRNPA1，都可以组装成淀粉状原纤维的多分散液相和有序固相。前者反映了生物颗粒的组装，而后者通常与神经退行性疾病有关。为了从可逆的原纤维形成中受益并规避不可逆原纤维形成的风险，细胞需要对蛋白质相分离进行严格调控，否则蛋白质相分离可能会导致疾病。在研究〔17〕中观察到hnRNPA1的可逆淀粉样蛋白形成，与液相-液相分离同步，调节液状液滴的流动性，并促进hnRNPA1募集到应激颗粒中。可逆的淀粉样蛋白的形成降低了hnRNPA1液滴的流动性，因此加强了相分离。hnRNPA1的可逆淀粉样蛋白核心形成有助于原纤维的可逆性，并解释了由家族性ALS中鉴定的Asp突变引起的不可逆的病理原纤维形成。尽管尚未出现关于突变体hnRNPA1如何导致神经功能障碍的明确共识，但已经积累了大量证据表明hnRNPA1错误折叠和纤维化与疾病有关，也有其他研究表明ALS发病机制可能仅是由于hnRNPA1水平的变化。

3.2hnRNPA2/B1 hnRNPA2/B1以两种不同的亚型A2(341个氨基酸)和B1(353个氨基酸)存在，均由HNRNPA2B1基因转录而来，主要定位于细胞核。hnRNPA2/B1含有两个RNA结合基序(RRM)，并且在其C末端附近具有富含Gly的结构域。hnRNPA2/B1蛋白是最丰富的RBPs之一，是真核细胞中与新生转录RNA结合的核蛋白复合体的核心〔18〕。在朊病毒样富集域(PRLD)中，由强突变的空间拉链基序引起的失调聚合可引发退化性疾病。因此，与PrLDs相关的蛋白应该被认为是引发和传播肌肉、大脑、运动神经元和骨骼蛋白病变的候选蛋白。PrLDs的聚合是有序相变的基础，这种相变驱动包括RNA颗粒在内的非膜结合细胞器的组装，而RNA颗粒是RNA代谢的许多方面发生反应的关键。疾病突变将更强的空间拉链引入hnRNPA2/B1和hnRNPA1的PrLDs中，调控、加速成核和聚合，改变RNA颗粒组装动力学，可能对RNA代谢产生了不良后果。除了hnRNPA2/B1和hnRNPA1外，至少还有4种携带PrLDs的RBPs(TDP-43、FUS、EWSR1和TAF15)在疾病病理学中积累。研究者在多系统蛋白病(MSP)的患者中发现了编码HNRNPA2/B1的基因突变，其患者肌肉组织的免疫组化染色表明，与疾病相关的突变导致hnRNPA2 / B1蛋白的核清除率增加，并与TDP-43共同定位于胞质异常蛋白聚集体和(或)应激颗粒中〔19〕。

3.3MATR3 MATR3是一种分子量为125 kD的核基质蛋白，可以结合DNA和RNA。有研究使用外显子组测序，在ALS 患者中鉴定了MATR3的突变〔20〕，值得注意的是MATR3的Ser85Cys突变与ALS的缓慢进展有关，而携带Phe115Cys突变的患者通常在出现症状的5年内死于呼吸衰竭，其他ALS基因也有类似的表型变异。在ALS患者中，在运动神经元的细胞核中观察到了MATR3，偶尔在细胞质中也存在。MATR3具有多种功能，包括RNA处理、保留超编辑过的RNA、通过与含多结构域蛋白(Ago)复合物的相互作用而使基因沉默及在N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA)谷氨酸受体激活后介导神经元细胞死亡。MATR3相关的S85C突变所致远端肌病患者可能患有家族性ALS〔21〕。MATR3可结合并调节长链非编码RNA(lncRNA)Neat1水平及调节肌细胞中肌钙蛋白RNA的编辑〔22〕。MATR3的锌指结构介导过表达毒性，其RRM调节亚细胞分布。RNA结合缺陷的MATR3变体的毒性高度依赖于其亚细胞分布，弥漫性MATR3不能结合RNA时，它具有很高的神经毒性，将RNA结合缺陷的MATR3变体螯合入核颗粒时毒性减弱〔23〕。部分致病性MATR3突变的会影响蛋白质的溶解度和稳定性〔23〕，这种现象也很好地解释了基因突变表型的变异。MATR3过表达和敲低均可引起神经元显著的毒性反应，说明神经元对MATR3水平的变化具有双向易感性。对散发性和家族性ALS患者中MATR3分布的尸检研究显示，MATR3核染色较强，运动神经元中存在胞质MATR3聚集物〔24〕。虽然这些发现的影响尚不清楚，但MATR3的定位错误或被螯合成聚合体可能影响其正常功能，或产生异常功能，或两者兼有。

3.4SETX SETX是一种由2 677个氨基酸组成的DNA/RNA解旋酶〔25〕，参与DNA修复、复制、重组和转录，RNA加工、转录物稳定性和翻译起始〔26〕，该蛋白与RNA/DNA解旋酶的酵母Sen1p家族成员表现出相当大的同源性。SETX基因中的T3I、L389S、T1118I、C1554G、K2029E、R2136H、I2547T等多个错义突变被报道与ALS4相关〔27〕。SETX蛋白功能的毒性增强导致了ALS4的运动神经元病理，而SETX功能的丧失导致了神经退行性疾病共济失调伴动眼性失用症(AOA)2，这是一种病理范围更广的疾病〔26〕。SETX对RNA DNA杂交体(R-loop)的分解至关重要，已知SETX缺失会导致R-loop和DNA双链断裂(DSBs)积累，这些持续转录的DSBs会随着时间的推移在神经元细胞中积累，导致神经退行性疾病〔28〕。SETX基因突变的ALS4小鼠模型的神经病理学特征显示核内TDP-43减少，并伴有TDP-43胞质的错误定位，这与在人ALS患者中观察到的标志性病理一致；SETX ALS4小鼠的运动神经元内应激颗粒形成增多、核膜异常，胞内物质入核延迟，表明核质运输受损；SETX ALS4小鼠的研究阐明了与TDP-43定位错误相关的ALS疾病表型，并为TDP-43组织病理学提供了深入的了解，将SETX功能障碍与ALS运动神经元退化的常见通路联系起来〔29〕。

3.5ELP3 ELP3是RNA聚合酶Ⅱ核心组成成分，此酶由6个亚基组成(ELP1～ELP6)，参与组蛋白H3和H4的乙酰化，使DNA进入转录〔30〕。Simpson等〔31〕进行了两项独立的研究:第一项是基于单核苷酸多态性的人类ALS基因关联研究，第二项是果蝇的诱变筛选。在这两种情况下，相同基因的变体，即ELP3被认为是轴突生物学的关键，这得到了进一步功能研究的支持。随后ELP3被确定为携带C9orf72重复扩增的患者延长生存的调节因子〔32〕，通过参与组蛋白H3和H4中赖氨酸残基的三甲基化降低扩展载体中C9ORF72的表达〔33〕。研究ELP3在SOD1 G93A小鼠中的作用发现，ELP3在脑和脊髓中的表达降低，ELP3表达在有症状的前期和有症状的阶段均具有保护作用，然而在有症状前的SOD1G93A小鼠中，神经元中特异性地增加ELP3的表达本身并不足以延长其存活时间。ELP3通过维持轴突完整性发挥了保护作用，而不是通过维持运动神经元的存活发挥作用〔34〕。

3.6ATXN2 ATXN2是一种真核RBPs，在RNA代谢调控中发挥着多种作用，包括调控mRNA的稳定性、聚腺苷酸化和翻译激活等〔35～37〕。ATXN2在N端通常含有约22个polyQ重复，大于34个polyQ重复的扩增将导致脊髓小脑共济失调2型(SCA2)〔38〕。ATXN2是polyQ疾病基因，Zmber等〔38〕研究分析了900多例散发性和家族性ALS患者中polyQ重复序列的长度，表明ATXN2中长度polyQ扩增与ALS有显著关联(约占4.7%的病例)，据此提出ATXN2是一个新的潜在的ALS疾病基因。TDP-43毒性在ATXN2水平上调时更为严重，降低ATXN2后，TDP-43毒性显著降低。由ATXN2水平引起的毒性增强并非仅归因于TDP-43蛋白水平的升高，因为在此蛋白上调后，变性的程度比仅具有更高水平的TDP-43严重得多〔39〕。同样，突变体ATXN2的表达也增强了突变体FUS的毒性〔40〕。最近的一项研究在ATXN2中发现了相分离和压力颗粒组装及长期记忆和神经退化所需的结构域〔41〕，相对于其他RBPs， ATXN2独特的结构和功能说明了ALS分子机制的复杂性。

3.7ANG ANG是一种诱导新生血管形成的血管生成分子，属于核糖核酸酶(RNase)a超家族，具有与RNase a相同的催化性能〔42,43〕。Adams等〔44〕在血管内皮生长因子(VEGF)基因中发现了具有生物学效应的序列变异，相关蛋白ANG的基因位于14q11.2号染色体上，并在2例散发性ALS患者中发现了一种新的突变，这种突变可能抑制ANG的功能。有研究表明ANG变体与帕金森病(PD)、ALS 之间存在明确的关联，ANG变体是两种疾病的易感因素〔45〕。在FUS(1-359) ALS小鼠模型中，血管损伤先于运动神经元的丢失，但ANG治疗不影响小鼠模型的生存或抗血管退化〔46〕。ANG在神经外胚层分化过程中表达于神经元细胞，并且具有神经营养和神经保护功能。ANG-ALS结构变异可影响神经元的存活及诱导神经元细胞应激颗粒的形成〔47〕。研究表明ANG的神经保护作用是通过激活磷脂酰肌醇3-磷酸(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信号通路抑制细胞凋亡〔48〕。运用鼠类神经元和星形细胞系发现ANG可激活Nrf2通路，从而提供细胞抗氧化应激的关键防御，但此机制发生在星形胶质细胞中，而非运动神经元〔46〕。这些发现扩展了ANG作为神经保护剂的作用，并强调了其在ALS管理中的潜在效用。进一步对这些ANG-ALS变异体的结构功能进行研究，也为深入了解它们在ALS中所起作用的细胞和分子机制提供了新思路。

3.8SMN SMN是一个普遍表达，存在于细胞核和细胞质中的RBPs。到目前为止，人们已经很清楚地认识到SMN与其他至少8种蛋白质结合在一起，形成大分子复合物。SMN复合物与Sm蛋白和snRNA相互作用，并协助它们组装成剪接体小核核糖核酸(snRNPs)，snRNPs是mRNA前剪接机制的重要组成部分，催化从细胞核中的mRNA前体切除内含子〔49〕。即SMN作为一个分子伴侣，通过与细胞核内多个RBP的相互作用，促进核内snRNP剪接体组装，并在胞质中组装和转运RNP颗粒。人类基因组包含2个SMN基因：SMN1端粒基因，其纯合缺失会导致脊髓性ALS(SMA)；SMN2着丝粒基因，其拷贝数调节SMA表型。它们之间只有5个核苷酸不同，该基因主要由于外显子7跳跃性翻译而产生截短的不稳定蛋白，仅有10%全长转录后成为功能性SMN〔50〕。虽然SMN1的纯合缺失与ALS不相关，但异常的SMN1拷贝数显著增加了患ALS的风险〔51〕。

4 讨 论

RBPs缺陷可引起神经变性疾病，其生理和病理功能存在明显的交叉或重叠。现已发现一些与ALS密切相关的RBPs具有介导疾病过程的特异性结构和功能特性，其中最引人注目的结构特性是LC域。当在LC域中包含ALS连锁突变基因时，RBPs与聚集或原纤维化倾向增加、细胞质错位及应激颗粒动力学失调有关，表明LC域在ALS发病机理中起重要作用。但并非所有ALS连接的RBP都具有定义的LC结构域(如MATR3和ATXN2)，表明可能存在其他致病机制。上下运动神经元是体内最长的细胞，完整的功能需要在近一米的距离内运输RNP颗粒。也许，由于其独特的生理学，运动神经元最容易受到RNA运输机械中的细微干扰。RNA剪接在神经系统细胞中比在任何其他细胞类型中都普遍，通过可变剪接可致基因表达具有多样性。如果中枢神经系统的正常功能需要微调可变剪接，那么大脑和脊髓细胞可能对RNA剪接或其他RNA处理过程的改变极其敏感，这些改变在其他组织中未被注意到。其次根据定义，这些RBP在RNA代谢中发挥功能性作用，包括转录、RNA加工、mRNA输出和稳定性及翻译调控。这些蛋白质中与ALS相关的突变可能会影响基因表达，从而影响某些细胞过程，包括DNA修复反应、细胞凋亡及细胞生长和增殖。或许这些蛋白生理和病理功能存在重叠及相互作用和影响，导致很难查明这些RBP以导致ALS的单个或几个路径或机制。更好地了解这些RBP的正常功能及病理意义对于阐明这种破坏性疾病背后的生物学特性至关重要。