MicroRNA在缺血性脑卒中发生发展及其诊断治疗中的作用研究进展

杨利强 关欣 徐伟杰 武煜明 (昆明卫生职业学院，云南 昆明 650600；云南中医药大学)

脑卒中是一种脑血管病变引起的神经功能丧失的神经系统疾病，具有死亡率高、发病率高、致残率高等特点〔1,2〕。我国现有1 100万例急性脑缺血患者，且每年新发病约240万例〔3〕。最新研究表明，脑卒中已成为我国居民致死原因第一位〔3〕。存活的患者中70%～80%有不同程度的神经功能缺陷，重度致残者占40%，严重影响患者生活质量，加大了家庭和社会负担〔4,5〕。因此，研究其发病机制及发病过程中人体生理的动态变化有重要意义。MicroRNA(miRNA)是一类高度保守的内源性非编码小RNA。大量研究表明，脑内的miRNA表达水平变化与脑缺血发生过程具有一定的相关性，即miRNA参与缺血性脑卒中的病理发生发展过程〔6〕。本文综合近年的相关研究，重点讨论miRNA在缺血性脑卒中病理发生发展过程中的作用，为脑卒中新的治疗方向提供一定的理论基础。

1 miRNA的生物学特性

miRNA是一类由20～24个核苷酸组成的内源性非编码单链小分子RNA〔7〕。广泛存在于真核生物体内，大量研究证实miRNA在各类物种中均具有高度保守性〔8〕。miRNA从生成到成熟涉及一系列步骤。miRNA首先在细胞核内通过RNA聚合酶Ⅱ作用转录形成具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴的pri-miRNA，在核酸酶Drosha和辅助因子Pasha作用下pri-miRNA被加工处理成含有发夹结构，长60～70核苷酸的pre-miRNA〔9〕。pre-miRNA被RNA-GTP和exportin5从细胞核输送到细胞质，然后在核酸内切酶ⅢDicer作用下剪切形成21～23 bp的成熟miRNA〔10〕。miRNA可以通过完全互补或部分互补靶向mRNA的3′-非编码区(UTR)，诱导mRNA降解或抑制mRNA翻译，在转录后水平调控靶基因的表达，从而参与细胞增殖、分化、凋亡等生物体发育生长、衰老、死亡等过程〔11,12〕。目前，在人类基因组中已经证实约1 500个基因由miRNAs编码，在不同的生理和生存环境下调节各种mRNA表达〔13〕。在生物体中，每个miRNA可以作用于多个靶基因，而多个miRNAs也可以共同调控同一个靶基因表达，因此，miRNA和靶基因在体内形成了一个复杂的调控网络。

2 miRNA与缺血性脑卒中病理发生发展的相关性

缺血性脑卒中的发生发展机制较为复杂，是时间和空间上同时激活的级联反应。具体机制主要包括大脑血脑屏障的破坏、神经炎症反应的激活、自由基的氧化应激及细胞自噬、凋亡等一系列反应〔14〕。从病理发生发展的具体机制进行靶点阻断，对缺血后神经功能的保护及脑功能区神经网络的重塑具有重要作用，因此深入探寻miRNA与缺血性脑卒中病理发生发展的相关性对缺血治疗策略具有重要的指导意义。

2.1miRNAs与血脑屏障 脑缺血发生后会引起基质金属蛋白酶(MMPs)、水通道蛋白(AQP)等因子表达水平升高。MMPs是破坏血脑屏障(BBB)的关键成分，缺血性脑损伤发生后，由促炎性因子诱导产生，从而破坏BBB的完整性，导致缺血性损伤可能向出血性损伤转变。研究证实miRNA-21、miRNA-105和miR-128在表达水平升高时会引起MMPs活化，导致其表达水平增加，促进脑水肿的形成，加剧脑损伤〔15,16〕。有研究表明，抑制脑缺血后miR-15a、miR-497表达水平，可以增加B细胞淋巴瘤(Bcl)-2蛋白水平和减少半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3活性，从而减轻脑缺血后BBB的破坏和脑梗死体积，对神经功能缺损起到改善作用〔17,18〕。因此，深入研究miRNA与BBB两者间的相互关系对脑缺血治疗具有重要作用。

2.2miRNAs与脑缺血炎症反应的关系 缺血发生后会激活神经炎症反应并在之后的病理过程中持续产生影响。大量研究表明，炎症反应是导致急性缺血阶段脑损伤的重要因素之一，其中中性粒细胞的聚集、浸润是炎症反应激活的关键〔19〕。研究证实，miR-155和miR-328影响中性粒细胞的募集，同时通过负反馈调节影响中性粒细胞的吞噬作用、弹性蛋白酶的活性及活性氧(ROS)的产生，从而减轻了中性粒细胞的杀伤能力〔20,21〕。在急性缺血阶段炎症反应的爆发会引起谷氨酸、ROS、NO等有害因子的大量分泌，而体外研究表明，过表达miRNA-23A可减少氧化应激反应中产生的ROS，从而起到保护作用〔19〕。最近研究还证实，低氧诱导因子(HIF)-1可以调控低氧条件下miRNA-210表达水平，而miRNA-210能够抑制呼吸电子传递链复合体Ⅰ中铁硫蛋白的支架蛋白ISCU1/2的表达，因此可以通过调节呼吸电子传递链复合体Ⅰ的正常表达，从而调控缺血过程中ROS的产生来减少缺血损伤〔22〕。miR-124也可以调节小胶质细胞的生存状态，使其从促炎状态向抗炎状态转化〔23〕。这些miRNAs在炎症反应中的作用均为临床脑缺血治疗中控制炎症反应减轻神经损伤提供了更广阔的思路。

2.3miRNAs与细胞凋亡 当脑部血流中断时，缺血中心区域的营养和能量供应在几分钟内会消耗枯竭，从而导致缺血核心区的神经元出现不可逆的坏死性死亡。然而在缺血半影区和周边区域的神经元会受到不同程度的缺血影响，呈现不同的命运。这个过程中会导致酪氨酸激酶(JAK)2、蛋白激酶B(AKT)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)等多种信号通路激活，调控下游相关凋亡基因的表达水平，从而影响神经元的凋亡〔24〕。研究证实，脑卒中后过表达miR-582-5p会通过激活蛋白酶活化受体(PRA)-1来调控神经元凋亡，而低表达miR-134可以通过调节靶基因HSPA12B表达来保护缺血再灌注损伤〔25〕。研究表明，在脑缺血再灌注损伤模型中注射miR-106b-5p拮抗剂可显著降低体内由于自由基脂质过氧化产生的丙二醛对细胞的损伤作用，同时恢复超氧化物歧化酶(SOD)的活性，增加髓样细胞白血病(Mcl)-1和Bcl-2蛋白表达水平，从而减少细胞凋亡的损伤〔26〕。体外实验也证实，在PC12细胞中添加miR-106b-5p抑制剂增加了Mcl-1和Bcl-2表达水平，从而减轻了谷氨酸诱导的氧化损伤和细胞凋亡〔26〕。以上结果表明，在缺血缺氧过程中miRNAs可以通过调节细胞凋亡来减轻缺血损伤，这可能是一种潜在的神经保护机制。

2.4miRNAs与神经发生 脑缺血发生后会出现大量的神经元死亡，从而导致患者神经功能障碍。脑缺血后神经发生在时间和空间上是一个动态发展的过程，需要大量的神经生长因子和一系列信号通路的级联反应参与。近年来的研究也表明，miRNA在胚胎的发育成熟、成体神经的发生及缺血性脑损伤后的神经发生过程中都发挥着重要的调控作用〔27〕。

研究发现，在嗅球、海马和纹状体等脑内再生能力旺盛的区域，由神经干细胞分化的新生神经元整合到现有神经网络的过程中，被CREB上调的miR-132显著促进突触连接的形成和神经递质传递〔28,29〕。体外研究也证实，高表达状态的miR-132促进神经突的生长发育和新突触的建立，而抑制miR-132的表达会导致树突生长能力显著减弱和突触密度降低〔30〕。在大鼠原代皮层神经元中有20%～40%的miRNA表达可能受神经发育调节，同时，一些miRNA的表达水平(如miR-128、-191、-323、-324-5p、-326、-329和-344)显著增加，和其在皮层神经发育中的表达趋势一致〔31〕。在神经元分化(miR-23、-23b)和突触形成中也发现了特异性表达的miRNA谱图〔31〕。研究发现阻断脑富集非编码小RNA miR-124会引起脑室下区(SVZ)细胞保持分裂状态，而miR-124的异位表达能够促进早熟神经元分化〔32〕。在神经再生期间敲低内源性miR-124会导致增生的形成和神经元再生的延迟。鉴定发现Sox9是SVZ成神经细胞中miRNA-124的重要生理靶点，在SVZ细胞中过表达Sox9会抑制神经元的产生；相反，敲低Sox9基因则导致神经发生增加和神经胶质形成减少〔33〕。因此，我们应该增加脑缺血后通过调控相关 miRNA 的表达水平来干预或刺激神经发生来恢复脑卒中患者神经功能的研究，为脑卒中治疗提供一种新的治疗方向。

3 miRNAs在脑缺血诊治过程中的应用

目前，在临床上治疗脑缺血疾病得到认可并有效使用药物依然很少。组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)就是公认的能够有效使用的溶栓药物，但由于其在使用过程中有应用时间窗(3～6 h)要求，从而受到了极大的使用限制〔34〕。当前关于脑缺血疾病治疗的研究主要集中在缺血核心区血流运输的重塑及神经元的再生，然而血管重塑和神经元再生涉及的机制比较复杂，所以仍然需要我们积极深入探寻新的治疗靶点。通过对急性缺血性脑卒中患者的血清进行miRNA芯片分析发现115种miRNA呈现差异性表达，其中hsa-let-7f、miR-126、miR-1259、miR-142-3p、miR-15b、miR-186、miR-519e、miR-768-5p表达下调及rno-miR-19b，rno-miR-290，rno-miR-292-5p表达上调〔35〕。用C57BL/6小鼠构建大脑中动脉栓塞(MCAO)模型研究脑缺血再灌注损伤后miRNAs变化时，发现缺血模型组有24种循环miRNAs表达丰度出现了上调，其中miR-1264、miR-1298、miR-448在再灌注3 h后表达量达到高峰，此后呈现逐渐下降趋势，而在出血性模型组中循环miRNAs水平并没有变化〔36〕。这些结果提示我们这些miRNAs不仅可以作为急性脑缺血诊断的生物学标志物，还可以成为潜在的治疗靶点。

miRNA除了作为脑缺血诊断和预测的生物学标志物，对于脑缺血的治疗也有一定意义。miRNA可以同时调控多个靶基因的表达水平，参与脑缺血病理发生发展过程的调节〔37〕，因此有望成为缺血性脑卒中治疗的潜在靶点。目前，针对miRNA进行干预或影响主要是通过antagomi与miRNA强竞争性结合，阻止miRNA与其靶基因mRNA的互补配对，从而抑制miRNA发挥作用或使用miRNA mimics增强内源性miRNA的功能，从而提高其沉默作用。上述研究方法在体内体外实验的成功验证让我们相信随着研究的进一步深入，miRNA有治疗缺血性脑卒中的潜力。

综上，miRNAs在生物体内的基因表达网络中起着重要的调控作用，参与了发育、内环境稳定及多种生理病理的反应和多种信号通路途径的调节。缺血性脑卒中的病理发生发展和修复在时间、空间上是一个动态变化的过程，其中涉及BBB的破坏、神经炎症反应、细胞凋亡、神经发生等。众所周知，随着miRNA的研究深入，其在疾病诊断治疗应用中越来越广泛，miRNA在缺血性脑卒中病理发生发展和修复过程中的研究也是目前的热点之一。同时，miRNA由于其结构简单易于合成，而且可以穿越BBB，并且在外周血清中稳定表达的特点，揭示了它在临床疾病诊断和治疗中的潜力，为其成为缺血性脑卒中临床诊断的生物标志物和治疗靶点提供了可能。