电化学发光检测乙肝血清学标志物相关试剂的性能验证

史云峰 杜卉莲 盘锦辽油宝石花医院 （辽宁 盘锦 124010）

内容提要： 目的：观察电化学发光法检测乙肝血清学标志物相关试剂性能的全过程，验证该方法的准确度。方法：选择美国贝特曼库尔特公司生产的UniCel DxI800全自动免疫分析仪，基于CLSI的EP15-A的标准，对精密度结果、准确程度、线性范围等进行检测。结果：①乙肝五项检测批内CV测定结果均在厂家提供数值之下，总CV测定结果均在厂家提供数值之下；②基于UniCel DxI800全自动电化学发光免疫分析仪检测乙肝五项，三次实验室间质检测结果显示，PT均达到100%，准确程度满足要求；③基于检测结果的回归曲线显示，r2=0.9958，处于“上下波动临界值0.03”的范围之内，超过0.95，符合标准要求。结论：通过电化学发光法检测乙肝血清学标志物相关试剂的性能，检测结果十分理想。

慢性乙型肝炎（简称，乙肝）由乙型肝炎病毒持续感染超过6个月以上，导致肝脏发生不同程度的炎症坏死或纤维化。目前，临床针对乙肝的血清学检查分为两种，其一，常规的乙肝五项检测。主要检测内容为：①表面抗原（HBsAg），直接检测患者体内是否存在乙肝病毒；②表面抗体（抗-HBs），检测患者免疫功能是否对乙肝病毒具备抵抗性，能否有效保证患者身体安全；③е抗原（HBeAg），主要检测已经侵入患者身体的病毒是否复制及具有传染性；④е抗体（抗-HBe），检测入侵浸提的病毒的复制过程能够在何种程度上受到抑制，或是否能够受到抑制；⑤核心抗体（抗-HBc），主要检测患者是否感染过乙肝病毒，有无乙肝病史。检测乙肝五项的意义在于：人类感染乙肝病毒的全周期内，在急性期可以检测到很高的抗-HBc水平；当急性期过后，抗-HBc水平仍会在若干年的时间内保持一定的高度，此外，在一些处于慢性乙肝感染状态的患者或是病毒潜伏期（乙肝病毒携带者）人员的身体中，抗-HBc也会在较长时间内保持较高水平[1]。对于HBsAg阴性患者而言，其抗-HBc也会呈现出阳性。总体而言，进行抗-HBc检测，能够确定患者是否有过乙肝感染史，在此基础上，检测其他四项指标，能够确定患者是否处于乙肝急性发作期及病情严重程度。总之，乙肝五项是一种通过患者自身各项抗体、抗原的水平，判断其是否患有乙肝疾病（携带乙肝病毒）的方式，可笼统地归纳为“间接检测法”。其二，乙肝病毒的DNA检测[2]。此种方法即直接检测患者体内是否含有乙肝病毒，若DNA检测结果显示，病原体的基因组序列与乙肝病毒一致，则可确诊；若不一致，则说明患者体内很可能不含有乙肝病毒。为了提升检测结果的准确性，可以对乙肝血清学标志物相关试剂的性能进行验证。本研究围绕电化学发光检测法的实际效果展开分析，现将有关结果进行整理，汇报如下。

1.资料与方法

1.1 仪器与试剂

选择美国贝特曼库尔特公司生产的UniCel DxI800全自动免疫分析仪，其特点如下。

第一，采用AMPPD第三代“辉光型”电化学或化学发光技术，发光底物成熟度和稳定性均可保持较高的水准；检验过程的灵敏度较高，可达10～21mol/L，其内运用的磁性微粒子技术的优势为：加快反应速度，能够在短时间内迅速捕获抗原、抗体，提高发光强度，快速达到稳定并长时间维持发光，保证生成结果处于准确度[3]。

第二，每小时可完成400份测试，相关数据的生成及分析过程极快；能够对检测样本进行预分杯（分立4个进样系统、采用一体化的整系统检测方式，其中，4个进样通道的优势如下：①加快进样速度、任一通道故障不影响其他操作、提高灵活性；②根据需要可任意指定检测项目、保证整系统流程的最优化；③共享一个检测、孵育系统、共享一套冲洗、读数系统；④使用同一个光量子探测器、共享一个定标和QC结果）；此外，借助冷藏技术，大大提升样本分析前的质量控制水平。

第三，仪器自带超声波清洗、混合液搅拌技术，降低携带污染率，提升分析准确性[4]。

本研究悬念用上海科华公司生产的乙型肝炎病毒五项检测试剂盒，批准文号为国械注准20163400924，HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb五项分别选择试剂盒（试纸条）、配套定标液、水平1质控品、水平2质控品[5]。

1.2 方法

针对质控品：每天检测两个浓度水平，连续5d进行，每天必须完成1批检测，且每批每个水平均需连续进行3次重复测定。重点检测结果为批内的变异系数和总变异系数，与试剂生产厂家提供的相关数据进行对比。经过实验室验证的变异系数小于厂家给出的临界标准值，则视为试剂性能达标，符合厂家的说明[6]。

对试剂的准确程度进行验证。本研究供选用两个批次共计10个水平的试剂质控品，根据我国卫生部临床检验中心室间质评质控评价的相关标准，如果验证结果超过国家规定标准的80%，则说明试剂质控品的准确程度较高（合格率符合要求）[7]。

针对HBsAb定量进行验证时，应分别选取HBsAb的最低值以及最高值血清标本，标注为ML和MH（本研究测定的对应值分别为2.86IU/mL以及976.34IU/mL）；选择标本时，应当尽可能地与实际说明书的线性范围最高限度、最低限度值进行“匹配”，并对高值血清进行稀释；每一份混合的血清标本，均应借助电化学发光仪器，完成至少两次平行检测，并计算出平均值，便于后续的回归分析。在验证之前，仪器必须时刻保证维持正常运转的状态。根据CLSI EP6-A标准，如结果分布图的斜率无限趋近于“1”，且上下波动范围均不超过0.03，并且r2值超过0.95，则可认为验证结果达到先行通过线性范围验证。

1.3 统计学分析

本研究基础数据由UniCel DxI800全自动电化学发光免疫分析仪自动生成，精密度结果由实际测量值与厂家提供值行直接对比；准确程度结果与卫生部临床检验中心室间质控评定标准值进行对比；线性范围趋势结果以线性回归曲线模式予以显示，以斜率作为分析界定标准。

2.结果

2.1 基于UniCel DxI800全自动电化学发光免疫分析仪的乙肝精密度结果

乙肝五项检测批内CV测定结果均在厂家提供数值之下，总CV测定结果均在厂家提供数值之下，见表1。

表1.基于UniCel DxI800全自动电化学发光免疫分析仪的乙肝精密度结果

2.2 准确程度结果

基于UniCel DxI800全自动电化学发光免疫分析仪检测乙肝五项，三次实验室间质检测结果显示，PT均达到100%，准确程度满足要求。

2.3 线性范围分布趋势结果

基于检测结果的回归曲线显示，r2=0.9958，处于“上下波动临界值0.03”的范围之内，超过0.95，符合标准要求。

3.讨论

目前，临床常用的电化学发光免疫测定系统包含电化学发光、磁性微粒子固相载体、链霉亲和素-生物素间接包被技术、检测系统共四个部分。其中，电化学发光免疫检测技术的核心为电化学发光技术，其标志物为三联吡啶、递电子体为三丙胺（Tripropylamine，TPA）、反应启动方式为直流电场。在电化学发光免疫检测技术的发展过程中，里程碑式的标记物为三联吡啶钌，该物质的核心优势为：①是一种分子量小，具备水溶性的物质；②整体结构稳定、应用于检测时，对检测样本造成的免疫损伤小，标记难度较低；③能够广泛应用于激素、DNA检定；④与三丙胺共同构成电化学发光系统。电化学发光的反应过程为：①发光标记物为三联吡啶钌；②发光底物为三丙胺；③在直流电场下启动；④反应产物为三丙胺自由基（TPA*）+620nm的光子[8]。按照上述过程，经过迅速、可控的反应之后，三联吡啶钌可“催化”三丙胺，发出可见光。深度反应过程为：①在电化学反应中，三丙胺分子在电极作用下，失去电子，形成阳离子三丙胺自由基；②继续反应期间，阳离子三丙胺自由基会失去氢离子，形成三丙胺自由基；③至此阶段，三丙胺自由基的后续反应分为两种：其一，在氧化作用下，形成二丙胺和丙醛；其二，继续失去电子，形成Ru（bpy）3+3，经过还原反应后，首先生成激发态的Ru（bpy）2+3，最终生成基态Ru（bpy）2+3（基态Ru（bpy）2+3失去电子后，会还原成Ru（bpy）2+3。在上述电化学发光免疫测定过程中，作为固相载体的物质可选择一种独特的磁性微粒，该物质的特性为：①直径达到2.8µm；②在其表面凸凹结构的作用下，包被面积会被放大；③该微粒在反应体系中处于“悬浮”状态，能够形成稳定、均匀的液相，可促使反应效能大幅度提升；④经过反应后的磁性微珠容易在电磁场的作用下，实现磁性吸引和分离。

在上述基础上，电化学发光免疫检测的过程为：①检测样本与经过反应生成的磁性微珠相结合；②转移至电极，完成标记后免疫复合物与游离组分的分离；③施加电压，启动化学发光反应；④对生成的信号进行检测。免疫复合物形成的具体过程为：第一抗体标记物生物素会与微磁珠相结合；第二抗体标记物Ruthenium会产生光信号。上述两种抗体都能够与靶抗原完成特异性结合。

总体而言，电化学发光免疫检测的优势为：①试剂稳定；②结果稳定性十分优异，样本呈现出的真实情况与检测结果之间几乎不会产生较大的差异；③检测结果的线性范围示范宽广，光子数范围为0～1亿；④检测过程的灵敏度极高；⑤检测过程中与“试剂使用”有关的步骤，在操作方面相对简便（如试剂联体包，成分独立、稳定性好），大幅度降低了误操作对检测结果造成的影响。

运用电化学发光法检测乙肝血清标志物的性能时，除了上文所述的优点之外，仪器自带的校准报警分析系统，能够实时反映漏测值方面产生的所有错误。比如，在“定标点”过程中，如果其中一个监测点未能及时生成结果，则定标报告会在相应的结果出显示出“NG”，从而告知检测人员，检测过程有所遗漏。故检测结果的准确性能够得到保证。

本研究以试剂质控品的精密度、准确程度、线性范围分布趋势作为检测指标，三项结果均符合生产厂家提供的资料，达到了厂家声称的性能标准，实验过程均达到实验室标准，验证结果可靠。