羟基红花黄色素A对老龄大鼠膝关节骨性关节炎的干预效果及作用机制

李清瀚 王大麟 王海涛 (北华大学临床医学院,吉林 吉林 132000)

膝关节骨性关节炎(KOA)主要病症是膝关节处的软骨组织出现退行性病变及膝关节周围出现骨质增生的现象〔1,2〕。KOA 的发病率较高,多发于中老年人,有研究显示,近些年KOA 的发病趋势呈现逐年上升〔3〕。目前关于KOA 的发病尚未完全阐明,关节软骨的损伤是不可逆的,药物或手术治疗均不能值KOA 的进展,因此,对于KOA 的治疗大多在于缓解炎症反应,改善关节功能,从而延缓疾病进展〔4,5〕。羟基红花黄色素(HSY)A 可以使过氧化氢引起的氧化胁迫状态得到有效的改善,还能够起到保护细胞及减轻氧化损伤的作用。具有抗炎活性〔6〕。本研究分析HSYA 对老龄KOA 的干预作用,明确HSYA 与KOA 的关系。

1 对象与方法

1.1 一般资料 选取18～21月龄SD 大鼠60 只,平均(18.53±1.42)月龄,体重450～520 g,平均体重(460.75±33.25)g,购自广州赛业百沐生物科技有限公司,生产许可证号:SCXK(粤)2020-0055,使用许可证号:SYXK(粤)2020-0242,雌雄各半,SD 大鼠均饲养于标准鼠笼,明暗周期12/12 h,相对湿度45%～50%,温度18～24℃,不间断供给水、食物,适应性饲养1 w。

1.2 分组与建模 在60 只大鼠中随机选取12 只作为正常组,其余大鼠均参照改良Hulth 法造模〔7〕,术前对大鼠进行腹腔注射麻醉,麻醉药物采用10%水合氯醛(300 mg/kg),将大鼠固定成呈仰卧位,做右下膝关节内侧1 cm 左右入刀,离断摘除前后交叉韧带、内侧半月板,然后进行髌骨复位,最后进行止血包扎。为预防大鼠出现感染状况,术后3 d 将青霉素20 万U/d 肌注到大鼠体内。术后第5 天让大鼠使用右下肢进行活动,每次活动时间为30 min,共干预4 w。干预4 w 后,随机抽取造模大鼠4 只及正常组1 只,并采用脱颈法将其处死,对造模关节软骨面进行观察,当大鼠关节囊略有增生,关节滑液多呈淡黄色及关节软骨表面略显粗糙,符合早期KOA 样改变,表示造模成功。

1.3 给药干预 造模成功后,将手术造模成功44 只大鼠随机分为模型组、HSYA 低剂量组、HSYA中剂量组、HSYA 高剂量组各11 只,HSYA 冻干粉购自成都康邦生物科技有限公司,将0.9%氯化钠注射液加入HSYA 中稀释成0.5 mg/ml 的溶液。HSYA 低剂量组给予大鼠浓度为2.5 mg/kg 的HSYA,HSYA 中剂量组给予大鼠浓度为5.0 mg/kg HSYA,HSYA 高剂量组基于大鼠浓度为10.0 mg/kg HSYA,3 组均注射到大鼠右侧膝关节腔部位,均注射量为20 μl,1 次/w,连续给药3 次,正常组及模型组每日各给予等量的生理盐水进行干预。

1.4 病理形态学观察 在喂养及给药3 w 后,采用脱颈法将大鼠处死,消毒后,准确剥取大鼠的右侧胫骨平台、股骨髁中及外侧软骨组织,迅速固定在4%的多聚甲醛溶液中,在常温的环境下固定48 h,随后流水冲洗数小时,随后对软骨标本进行脱钙处理。用生理盐水对脱钙后的软骨组织进行冲洗,乙醇脱水、浸蜡,石蜡包埋后进行厚度为4 μm 切片,铺片,苏木素染色,流水冲洗,在此进行乙醇脱水,在采用伊红染色,最后利用浓度为100%的酒精进行脱水处理,二甲苯透明,封片。

1.5 大鼠膝关节直径及足趾容积测量 对大鼠膝关节及足趾容积,分别采用游标卡尺,足趾容积仪进行测量,在对其进行对比。

1.6 炎症因子检测 取大鼠腹主动脉血,4℃在环境下进行2 000 r/min 的离心处理,离心20 min,半径为6 cm,并将上清液保存在-20℃冰箱内待测。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对炎症因子的含量进行检测,操作步骤均严格按照试剂盒说明书进行。

1.7 基质金属蛋白酶(MMP)-1、MMP-13、MMP 抑制剂(TIMP)-1 检测 应用荧光定量聚合酶链反应(PCR)进行检测,取大鼠软骨组织,剪碎,提取miRNA,具体操作参照试剂盒说明书,测定浓度及纯度后,将其反转录为cDNA,RNA 反转录试剂盒购自TaKaRa 宝生物工程有限公司,再以cDNA 为模板,加入相关试剂及引物后进行PCR 扩增,以GAPDH为内参,引物序列:GAPDH 上游引物5′-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3′,下游5′-TGAGCTTGACAAAGTGGTCG-3′,MMP-3 上游引物5′-GCAAATCCCTACTCAGAAG-3′,下游5′-TTTTCCAGTATCCTCCTCAG-3′,MMP-13 上游引物5′-TGACAGGCTCCGAGAAATG-3′,下游5′-CGTTGTATTCACCCACATCAG-3′,TIMP 上游引物5′-GCGTTATGAAATCAAGACCACCA-3′,下游5′-CGCAGTTGTCCAGCGATGAGA-3′,反应条件为:95℃3 min,变性95℃12 s,退火62℃40 s,共40 个循环,实验结果采用2-ΔΔCt进行计算MMP-1、MMP-13 和TIMP 的相对表达量。

1.8 通路蛋白相对表达 取大鼠待测软骨组织100 mg 按1 ∶5加入裂解液裂解、匀浆、提取总蛋白,经电泳、转膜后,5%脱脂牛奶封闭2 h,加入一抗(1 ∶300),孵育过夜。加入二抗(1 ∶5 000),常温孵育2 h,显影、定影、冲洗、晾干,置于凝胶图像成像分析系统,曝光各组蛋白条带,拍照,计算各组蛋白条带灰度值。

1.9 统计学处理 采用SPSS26.0 软件进行t检验、方差分析。

2 结 果

2.1 组织学观察 正常组软骨细胞饱满大小均一,排列整齐,表面平整,可见双核结构,潮线清晰完整。模型组软骨组织表面碎裂,软骨细胞缺失,细胞核浓缩,软骨细胞出现坏死。HSYA 低剂量组关节软骨表层变薄,软骨细胞出现缺失,表面出现裂隙,可清晰的看见软骨细胞出现坏死。HSYA 中剂量组关节软骨轻度变薄,软骨存在小裂隙,多个软骨细胞聚集。HSYA 高剂量组关节软骨变薄,软骨存在小裂隙,表层细胞形态接近于正常。见图1。

图1 各组软骨组织学观察(HE 染色,×200)

2.2 各组膝关节直径及足趾容积比较 与正常组相比,模型组、HSYA 低、中、高剂量组膝关节直径、足趾容积均明显升高(P＜0.05)。与模型组相比,HSYA 低、中、高剂量组膝关节直径、足趾容积均明显降低(P＜0.05),与HSYA 低剂量组相比,HSYA中、高剂量组膝关节直径、足趾容积均明显降低(P＜0.05)。与HSYA 中剂量组相比,HSYA 高剂量组膝关节直径、足趾容积均明显降低(P＜0.05)。见表1。

2.3 各组炎症因子表达比较 与正常组相比,模型组、HSYA 低、中、高剂量组IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17水平均明显升高(P＜0.05)。与模型组相比,HSYA低、中、高剂量组IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17 水平均明显降低(P＜0.05),与HSYA 低剂量组相比,HSYA中、高剂量组IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17 水平均明显降低(P＜0.05)。与HSYA 中剂量组相比,HSYA 高剂量组IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17 水平均明显降低(P＜0.05)。见表1。

表1 各组膝关节直径及足趾容积、炎症因子表达比较(±s,n=11)

表1 各组膝关节直径及足趾容积、炎症因子表达比较(±s,n=11)

与正常组比较:1)P＜0.05;与模型组比较:2)P＜0.05;与HSYA 低剂量组比较:3)P＜0.05;与HSYA 中剂量组比较:4)P＜0.05;表2 同

组别膝关节直径(mm)足趾容积(ml)IL-1β(ng/L)TNF-α(ng/L)IL-6(μg/L)IL-17(μg/L)1±0.0515.41±3.14模型组8.16±0.221)1.66±0.151)20.04±1.121)58.77±5.221)0.67±0.091)36.84±7.551)HSYA 低剂量组8.01±0.181)2)1.62±0.131)2)18.52±1.411)2)43.52±4.741)2)0.51±0071)2)30.71±6.841)2)HSYA 中剂量组7.94±0.161)2)3)1.52±0.101)2)3)13.42±1.371)2)3) 28.84±3.521)2)3)0.39±0.081)2)3)26.72±4.741)2)3)HSYA 高剂量组7.76±0.231)2)3)4) 1.47±0.091)2)3)4) 6.72±1.121)2)3)4) 15.52±3.251)2)3)4) 0.27±0.071)2)3)4) 17.54±2.151)2)3)4)F/P 值20.220/0.0017.316/0.00144.175/0.00147.1正常组7.16±0.111.41±0.086.04±1.115.16±2.170.2 75/0.00122.230/0.00113.038/0.001

2.4 各组信号核因子(NF)-κB 通路相对表达量比较 与正常组相比,模型组、HSYA 低、中、高剂量组核因子κB 抑制因子(IκB)α、NF-κB P65 表达均明显升高(P＜0.05)。与模型组相比,HSYA 低、中、高剂量组IκBα、NF-κB P65 表达均明显降低(P＜0.05),与HSYA 低剂量组相比,HSYA 中、高剂量组IκBα、NF-κB P65 表达均明显降低(P＜0.05)。与HSYA 中剂量组相比,HSYA 高剂量组IκBα、NF-κB P65 表达均明显降低(P＜0.05)。见图2、表2。

图2 各组软骨中NF-κB 通路蛋白表达

2.5 各组关节软骨中MMP-3、MMP-13、TIMP-1 表达对比 与正常组相比,模型组、HSYA 低、中、高剂量组MMP-3、MMP-13、TIMP-1 表达均明显升高(P＜0.05)。与模型组相比,HSYA 低、中、高剂量组MMP-3、MMP-13、TIMP-1 表达均明显降低(P＜0.05),与HSYA 低剂量组相比,HSYA 中、高剂量组MMP-3、MMP-13、TIMP-1 表达均明显降低(P＜0.05)。与HSYA 中剂量组相比,HSYA 高剂量组MMP-3、MMP-13、TIMP-1 表达均明显降低(P＜0.05)。见表2。

表2 各组关节软骨中MMP-3、MMP-13、TIMP-1、信号NF-κB 通路表达对比(±s,n=11)

表2 各组关节软骨中MMP-3、MMP-13、TIMP-1、信号NF-κB 通路表达对比(±s,n=11)

组别MMP-3MMP-13TIMP-1IκBαNF-κ B P65正常组25.42±7.1727.53±4.5216.47±4.081.00±0.011.00±0.01模型组78.24±10.211)81.61±5.721)30.62±4.151)2.53±0.331)2.24±0.391)HSYA 低剂量组61.58±6.571)2)66.67±5.141)2)27.52±5.331)2)2.08±0.241)2)2.02±0.311)2)HSYA 中剂量组41.74±8.831)2)3)47.78±5.881)2)3)23.57±4.581)2)3)1.82±0.171)2)3)1.68±0.251)2)3)HSYA 高剂量组33.14±7.251)2)3)4)35.74±5.691)2)3)4)19.57±4.691)2)3)4)1.34±0.131)2)3)4)1.24±0.151)2)3)4)F/P 值21.060/0.00136.900/0.00112.096/0.00123.055/0.00115.810/0.001

3 讨 论

关节软骨作为一种特殊的结缔组织,其软骨细胞转化率较低,因此软骨损伤后自我修复能力较差。同时,软骨细胞更新及代谢过程极为复杂,由多种细胞因子参与完成。软骨细胞凋亡、细胞外基质降解是导致KOA 软骨降低的主要因素〔8,9〕。中医学认为KOA 属“骨痹”范畴,其发病与肝、脾、肾亏损及风、寒、湿、瘀血客于局部密切相关〔10〕。

HSYA 临床在心血管疾病的治疗中起重要作用,HSYA 具有抗感染作用〔11〕。有相关研究表明〔12〕,HSYA 能够使LPS 得到有效抑制,进而使TNF-α、IL-1β、IL-6 及其他炎症因子的表达出现异常升高的状态。HSYA 还可以使髓过氧化物酶及一氧化氮合酶的活性得到抑制,进而缓解了脑组织中的浸润〔13,14〕。有研究显示,当关节软骨细胞出现的凋亡及软骨祖细胞出现迁移障碍时,其主要原因是因为关节软骨组织中分泌的MMP-1、MMP-13 表达呈现异常升高的状态,进而导致关节软骨无法再生。本研究进一步发现,HSYA 可使KOA 大鼠体内MMP-1、MMP-13 表达降低,从而延缓疾病进程。

KOA 发病与炎症因子之间存在着密切的相关性,关节软骨合成蛋白多糖组分、蛋白糖胺聚糖及Ⅱ型胶原蛋白均会因TNF-α 与IL-6 协同而出现不同程度的影响,协同IL-1β 在骨关节炎的发生过程中起着决定性的作用,IL-1β 对关节软细胞代谢及细胞外基质有着显著影响〔15,16〕。促进MMPs 的分泌来破坏关节软骨成分。本研究显示,IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17 在KOA 模型大鼠体内呈现高表达,HSYA 可减轻大鼠体内炎症因子表达,修复关节软骨损伤,抑制KOA 的发生进展。

NF-κB 信号通路是体内重要的炎症通路,其与机体内的炎症产生和激活均有不同程度的相关性。在KOA 炎症发生过程中NF-κB 是关键的转录分子,对KOA 的各个阶段均存在不同程度的影响。NF-κB 可以在生理状态下和IκB 进行结合,以复合物的状态存在于机体内〔17,18〕。NF-κB 活化的敏感标志是IκB 蛋白的表达,NF-κB P65、IκBα 分别为NF-κB、IκB 蛋白家族成员,二者可以使NF-κB 信号通路在膝关节骨中得到有效的抑制作用〔19,20〕。本研究结果表明NF-κB 通路激活,经HSYA 干预,NFκB P65、IκBα 在KOA 表达下调,表明HSYA 可抑制NF-κB P65、IκBα 活性,从而改善KOA 临床症状,减轻炎性反应。

虽然本文认为HSYA 具有改善KOA 的作用,其作用机制可能与炎症反应及NF-κB 通路有关,但临床并未有其他研究分析其关系,因此本研究所得结果还需后续研究验证,为KOA 的研究提供新方向。