金铃子散治疗附睾炎机制探讨:基于网络药理学

李嘉林，陈少明，黄铭锋，刘永强，梁文康，孙传涛

(广州市番禺区中医院，广东 广州 511400)

附睾炎是男性生殖系统非特异性感染的常见病，见于各年龄段的男性，但多为20～40岁的青壮年，占所有患者的70%[1-2]。分为急性附睾炎和慢性附睾炎两种类型，又以慢性型更为常见。主要临床表现为腹下腹股沟指征痛、阴囊肿大、站立或行走时疼痛加重等[3]。此外，体格检查可发现结节、肿块或变硬，伴有轻度或中度压痛，病理方面也可发现输精管扩张[4]。附睾炎病因复杂多样，但发病机制不同，通常被认为是继发于前列腺炎或尿路感染，该病可严重影响患者的心理健康和生活质量[5]。同时，由于附睾内不同程度的炎症反应，还可能减少精子的产生和发育，导致精子畸形明显增加[6]。目前，对附睾炎的确切治疗还没有定论，抗生素和抗炎药仍是主要治疗方法[7]。但对于复发性慢性附睾炎，由于结节的易感性，药物不易起效[8-9]。

近年来，中医药在临床试验中得到了广泛应用。研究表明，中药在减轻附睾慢性疼痛、减轻阴囊肿胀、抗组织纤维化等方面具有明显的疗效。中药中的一些特殊成分可以达到预期的外周镇痛效果，主要是通过调节机体功能，促进中枢神经系统内源性阿片肽的产生等[10]。此外，还可以通过增加炎性组织和血清中β-EP的水平发挥抗炎作用[11]。

金铃子散首见于刘完素《素问病机气宜保命集》，由川楝子和延胡索两味药物组成，方中川楝子行气解郁、苦寒泄热，为君药；延胡索活血化瘀、辛温散行，为臣药。行气以帅血，气行则血活，二药相配，共奏行气活血、泻热止痛之效，是治疗肝郁化火而致的胸胁、腹脘、疝气痛、痛经等痛症的代表方剂[12-13]。现代药理学研究发现，金铃子散水煎液具有明显的镇痛抗炎作用[14]，且复方制剂镇痛效果优于单药[15],我院在多年临证治疗过程中，常用金铃子散化裁方治疗急慢性附睾炎，临床效果显著，但目前对于该方剂治疗附睾炎的机理研究相对较少，整体性机制的研究有待提高，给该方剂的临床推广带来了障碍。

网络药理学是一种综合系统方法、计算方法和实验方法来阐明药物分子机制的研究方法[17]，可以多组分、多靶点地将药物成分靶点网络与生物靶点网络相结合，更加系统全面地研究药物的作用机制。因此，本研究运用网络药理学的方法对金铃子散治疗慢性附睾炎的成分及靶点进行归纳整理，通过药物与疾病靶点的融合，进而筛选出核心靶点，探讨其治疗疾病的作用机制，为探索中药方剂金铃子散治疗附睾炎的机制提供新的思路，为中医疗法治疗疾病寻找新的科学依据。

1 材料与方法

1.1 金铃子散活性成分筛选

通过计算系统生物学实验室平台(TCMSP)(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，分别检索川楝子和延胡索的化学成分，其中川楝子33个、延胡索49个。本研究结合药代动力学的吸收、分布、代谢、排泄(ADME)，以“口服吸收利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18”作为活性成分的筛选条件，并通过文献检索补充筛选条件之外的有效活性成分。

1.2 活性成分靶点预测

基于所筛选的化学成分，通过以下2种方式预测相关靶点：①通过TCMSP数据库查询靶点蛋白名称；②从PubChem数据库检索成分相关Canonical SMILES，从SwissTargetPrediction预测相关靶点。作为一个在线网络工具，SwissTargetPrediction基于相似原理，通过反向筛选预测小分子最可能的蛋白质靶标。最后通过Uniport数据库将成分所对应的蛋白名称转化为基因名，限定物种为“human”，从而获取成分相应靶点。

1.3 附睾炎疾病靶点整理

以附睾炎(Epididymitis)为关键词，从DisGeNET和GeneCards数据库检索疾病相关的靶点。DisGeNET是一个综合性的发现平台，其包含超过380 000个基因和13 000种疾病之间的关联，旨在解决与人类疾病的遗传基础有关的各种问题。此外，该平台涵盖孟德尔和复杂疾病的信息，并包含来自动物疾病模型的数据。它的特点是基于支持性证据的评分，以确定基因与疾病关联的优先顺序。GeneCards数据库作为一个开放的网络资源，它提供的信息旨在深入了解有关基因的现有知识，包括关注其在健康和疾病中的功能，包括了SWISS-PROT、OMIM、Genatlas和GDB数据库的数据，使用GeneCards数据库可以快速获取有关基因集功能的信息。最后将靶点基因导入UniProt数据库进行基因标准化后整理归纳。

1.4 潜在作用靶点筛选和蛋白-蛋白相互作用网络分析

应用Cytoscape 3.2.1软件将成分和疾病靶点进行映射，取其交集部分作为金铃子散治疗附睾炎的潜在治疗靶点。为了更好了解这些潜在靶点的治疗效果，应用STRING数据库对潜在靶点之间的相互关系进行研究，获得蛋白与蛋白之间的相互作用关系(Protein-protein interaction，PPI)。STRING数据库旨在为尽可能对已知和预测的关联进行评分和整合，形成覆盖超过1 100个生物体的综合蛋白质网络。

1.5 网络构建和分析

网络是各种连接节点和边的计算良好的数学模型。网络药理学的一个重要组成部分是网络分析，主要包括属性分析、拓扑分析、网络结构与稳定性分析。网络分析通常测量模块、介数、关键节点、边、最短路径和关键节点的自由度。本研究中网络图均应用Cytoscape 3.2.1软件，对生物网络进行可视化探索和分析。并应用Cytoscape构建：①中药-成分-靶点网络图；②中药-成分-交集靶点-疾病网络图；③核心靶点PPI网络图；④中药-成分-靶点-通路-疾病网络图。此外，利用Cytoscape 3.2.1中“Network Analyzer”功能对网络进行分析，以获得自由度(Degree)等网络拓扑参数，并分析网络节点的重要性。

1.6 潜在靶点功能富集分析与通路分析

为了进一步了解这些核心靶点的功能，通过DAVID数据库对关键靶点进行基因本体论(Gene Ontology，GO)生物学功能富集分析，获取生物过程(Biological process，BP)、细胞成分(Cellular component，CC)、分子功能(Molecular function，MF)等分析结果(P<0.05)；同时，也获得KEGG信号通路(P<0.05)富集分析结果。基于GO分析和KEGG分析探讨“金铃子散”治疗附睾炎的作用机制。

2 结果

2.1 金铃子散活性成分筛选

通过TCMSP数据平台，基于“ADME参数OB≥30%，DL≥0.18”条件初步筛选成分，得到金铃子散中川楝子9个活性成分、延胡索49个活性成分。其中，共同的活性成分1个。

近年来研究发现，川楝子中楝烷型三萜类化合物川楝素具有广泛的生物学效应，对全身多系统功能具有良好的调节作用[16]，因此补充川楝素(toosendanin)作为活性成分。综上所述，共得到金铃子散中58个活性成分。见表1。

表1 金铃子散活性成分信息

续表1

2.2 活性成分靶点预测

从TCMSP和SwissTargetPrediction预测得到成分相关靶点357个，其中Nimbolin D和melianone没有相关靶点。通过Cytoscape 3.2.1软件构建“活性成分-靶点网络”(图1)。此网络图包括416个节点(2个单味药节点、57个成分节点和357个靶点节点)、1 791条边。通过网络药理学分析，槲皮素(quercetin)、豆甾醇(stigmasterol)和金黄紫堇碱((S)-Scoulerine)具有较高的自由度，自由度越大，参与的生物功能越多，在网络中的重要性则越强。通过对以上成分的靶点进行分析可以发现，PTGS2和PTGS1的度值最高，这提示大多成分的靶点主要与炎症反应相关，可以广泛调控炎症因子、趋化因子、黏附分子、血管生长因子等。因此，从成分-靶点网络中可以看出，金铃子散对附睾炎的治疗作用可能主要集中在对炎症反应的调控方面。

注:正方形代表成分；圆形代表靶点；菱形代表草药。

2.3 疾病靶点收集和潜在作用靶点获取

从DisGeNET和Gene Cards数据库共搜集到955个靶点。利用Cytoscap 3.2.1中的Merged功能将成分靶点和疾病靶点进行融合，得到88个交集靶点作为金铃子散治疗附睾炎的潜在治疗靶点。应用Cytoscape软件构建花椒-成分-候选靶点-疾病网络图(图2)。从网络图中可以看出，川楝子与延胡索通过不同的成分作用于靶蛋白，进一步发挥治疗效果。因此，疗效的取得是通过成分与靶点的层级作用实现的。

注：菱形代表草药；正方形代表成分；圆形代表靶点；三角形代表疾病。

2.4 蛋白-蛋白相互作用网络分析

为了进一步深入了解这些潜在候选靶点之间的相互关系，应用STRING数据库获得蛋白与蛋白之间的相互关系。其中，88个潜在作用靶点有86个发生相互作用，将STRING数据导出，利用Cytoscape 3.2.1将蛋白之间的相互作用关系可视化(图3)，此网络图包括86个节点、891条边。通过对PPI网络进行拓扑分析，IL6、TNF、TP53和CASP3等靶点具有较高的度值，提示这些靶点在疾病的治疗过程中发挥着重要的作用。

注：圆形代表靶点。

2.5 基因本体论分析

通过DAVID数据库进行基因本体论(GO)分析，共获得874个分析条目；其中分子功能71个、生物过程772个、细胞组分31个(P<0.05)。按照富集分析P值进行排序，分别列举了排名前10位的富集分析结果(图4)。基因本体论分析结果表明，在分子功能中，主要与类固醇激素受体(GO：0003707 steroid hormone receptor activity)、配体依赖性核受体活性(GO：0004879 ligand-dependent nuclear receptor activity)、脂质结合(GO：0008289 lipid binding)和蛋白质二聚体活性(GO：0046983 protein dimerization activity)等分子功能相关(图5)；在生物过程中，主要涉及到细胞增殖的调节(GO：0042127 regulation of cell proliferation)、对有机物的反应(GO：0010033 response to organic substance)和凋亡(GO：0042981regulation of apoptosis)等生物过程(图6)；在细胞组成中，主要涉及到细胞外空间(GO：0005615 extracellular space)、胞外区部分(GO：0044421 extracellula region part)和神经元投射(GO：0043005 neuron projection)等功能。

图4 分子功能富集分析

图5 生物过程富集分析

图6 细胞组成富集分析

2.6 KEGG富集分析

通过DAVID在线分析平台对潜在治疗靶点进行KEGG通路富集分析，发现在86个核心靶点中，有52个参与到15条通路中。利用Cytoscape构建通路-靶点网络图(图7)，此网络图包括66个节点和88条边。对网络图进行拓扑分析，其中，TNF、IL6、IL2、IL10、MTOR和IL1B等靶点具有较有较高的度值，富集排名度值靠前的通路主要有细胞因子-细胞因子受体相互作用(hsa04060：Cytokine-cytokine cytokine receptor interaction)、钙信号通路(hsa04020：Calcium signaling pathway)、Jak-STAT信号通路(hsa04630：Jak-STAT signaling pathway)和凋亡(hsa04210：Apoptosis)等信号通路。通路分析显示信号通路及相关通路主要涉及到炎症、凋亡等方面，故金铃子散可能通过其有效活性成分作用于若干靶点，对多种信号通路产生进一步调控作用，从而发挥治疗附睾炎的作用。

注：“V”形代表通路，圆形代表靶点。

3 讨论

本研究通过多个数据库收集得到附睾炎的相关疾病靶点，提示附睾炎的发生可能是由多个靶点共同作用的结果。通过TCMSP数据库平台，基于药代动力学ADME参数，以“OB≥30%，DL≥0.18”为筛选条件，选取川楝子和延胡索中生物活性较好的58种化学成分。此外，结合文献检索得到筛选条件之外的活性成分川楝子素。通过成分靶点预测和网络构建分析，筛选出86个潜在作用靶点用于进一步分析。利用DAVID数据平台得到GO分析结果三类，包括分子功能、细胞组分和生物过程，就其生物过程而言，主要涉及凋亡和增殖。此外，KEGG通路富集分析结果提示，金铃子散主要涉及到炎症、凋亡等方面。

在泌尿生殖系统中，先天免疫系统和雄性生殖道之间的相互作用对于雄性生殖系统的发育和维持至关重要。附睾是精子成熟、保护和贮存过程中起关键作用的黏膜器官，附睾内的免疫环境必须紧密协调，以便迅速减轻可能危害成熟精子的致病威胁。这种环境还必须保持一个耐受性环境，以避免宿主免疫系统破坏自身抗原性精子[17]。尽管这些免疫机制对维持附睾内环境的稳定至关重要，但它们在很大程度上仍具有一定的未知性。了解附睾是如何感觉到并对入侵的细菌产生防御反应的，这对临床极为重要，因为细菌感染是附睾炎最常见的病因，而附睾炎是男性生殖系统常见的炎症性疾病[18]。因此，抗炎就是治疗附睾炎的首要方略。

炎症细胞因子与人体免疫系统抗炎成分之间存在着动态的、不断变化的平衡。这些细胞因子和细胞因子抑制剂对炎症的调节机制比较复杂，因为免疫系统有多余的途径，而多个元素具有相似的生理效应。此外，除了白细胞介素1受体拮抗剂(il-1ra)之外，所有的抗炎细胞因子至少都具有一些促炎特性。任何细胞因子的净效应取决于细胞因子释放的时间、作用的局部环境、竞争或协同元素的存在、细胞因子受体密度，以及组织对每种细胞因子的反应等[19]。基因、环境或微生物因素对细胞因子调节网络的干扰可能会产生非常有害的后果[20]。主要的抗炎细胞因子在附睾炎的治疗过程中可能发挥着举足轻重的作用。在通路-靶点网络图中，TNF、IL6、IL2、IL10和IL1B等炎症因子的度值较高，意味着这些炎症因子在疾病的治疗中发挥着重要的作用。在全反式维甲酸(atRA)减轻附睾炎急性炎症的机制研究中，通过构建小鼠附睾炎模型，连续5天腹腔注射全反式维甲酸。结果表明，atRA通过降低促炎细胞因子的表达，增加TGFβ1、Ⅱ-10等抗炎因子的表达，减轻了小鼠附睾炎的炎症反应。

此外，据研究报道，JAK激酶信号转导和转录激活因子(JAK-STAT)信号通路与类风湿关节炎、银屑和炎症性肠病等炎症性和自身免疫性疾病的发病有关。许多参与自身免疫和炎症性疾病发病机制的细胞因子使用JAKs和STATs来传递细胞内信号。本研究通过网络药理学数据挖掘和整合分析发现，JAK2/3和STAT1具有较高的度值，表明JAK-STAT信号通路在附睾炎的治疗中也发挥着重要作用，不过由于相关研究较少，此项结果有待进一步实验证实。

MTOR是一种磷酸肌醇-3-激酶相关蛋白激酶，作为一种变阻器在哺乳动物体内发挥作用，能够以营养素、能量和生长因子的形式整合各种环境信号，以调节组织过程和内稳。此外，TP53作为一个凋亡相关的基因，本研究发现MTOR和TP53同样作为治疗靶点(图8)，在金铃子散治疗附睾炎的过程中发挥着作用。然而，这些靶点与附睾炎的关系还需要深入研究。

图8 金铃子散治疗附睾炎的作用机制

本研究通过数据挖掘，在大量计算机运算法则的基础上，应用网络药理学对金铃子散的作用机制进行了预测，结果表明，其治疗附睾炎具有多成分、多靶点、多通路的作用特点。通过多种数据分析，网络药理学作为一种新的研究方法，可以极大提高工作效率，为未来中医药机制方面的研究提供了重要参考。