穿山龙对支气管哮喘大鼠CysLTs炎症通路的影响研究

李保君，王 园，张亚军

(内蒙古医科大学 中医学院，内蒙古 呼和浩特 010110)

支气管哮喘是一种慢性呼吸道非传染性疾病，在各个年龄段的人群中多发，严重影响生活质量，给社会带来经济负担，探索哮喘的预防方法并及时控制或缓解哮喘病情是当务之急。众所周知，哮喘是由多种炎症性细胞、炎症性介质和炎症性细胞因子互相协同作用的结果，气道炎症是哮喘最基本的发病特征之一[1-2]。目前治疗支气管哮喘的方法很多，一般采用抑制半胱氨酰白三烯(CysLTs)受体来阻断CysLTs的炎症通路，治疗效果较好[3]。

1 哮喘中医发病机制

中医认为“久病必瘀血”，哮喘的发病机制是由于哮喘的反复发作，引起肺气虚，造成气虚无力推血，最后形成气虚血瘀，故哮喘的防治要痰瘀同治，活血化瘀药物是不二之选。其中，穿山龙具有抗炎、调节免疫、镇咳祛痰等作用，临床上常用来治疗哮喘。穿山龙是薯蓣科薯蓣属植物穿龙薯蓣的根茎，主要含有薯蓣皂苷、薯蓣皂苷元、25-△-螺旋甾-3，5-二烯、纤细薯蓣皂苷、穗菝葜甾苷、25-D-螺甾-3，5-二烯及对羟基苄基酒石酸等有效物质[4]。一般认为，穿山龙可通过降低炎症通路上的主要炎症因子从而发挥治疗哮喘的作用，不过这种作用目前仍缺少客观的实验依据，本研究将通过大鼠实验探讨穿山龙治疗哮喘的作用机制。

2 材料与方法

2.1 实验动物

健康SD雌性大鼠50只，体质量(200±20)g，生产批号：SAXK(蒙)2019-0015，购于内蒙古医科大学动物实验中心。按标准饲养条件饲养：给予标准实验小鼠饲料，每天保证光照时间达12 h，关灯时间12 h，室温一般控制在25 ℃ 左右，室内相对湿度一般控制在50%～70%。确保所有大鼠能自行进食、饮水，在标准饲养环境中喂养1周后开始造模[5]。

2.2 实验用药品

穿山龙制剂：饮片煎煮、浓缩、冻干制成穿山龙冻干粉。孟鲁司特钠片由杭州默沙东制药有限公司提供。

2.3 主要试剂及仪器

主要试剂：氢氧化铝，卵蛋白，戊巴比妥钠，多聚甲醛溶液，苏木素-伊红(HE)染液，PBS磷酸盐缓冲液，三氯甲烷，引物等。主要仪器：匀浆仪，荧光定量PCR仪，自动组织脱水机，光学显微镜等。

2.4 实验方法

2.4.1 分组方法 经适应性喂养后，随机把大鼠分成5组，每组10只，分别是正常组、哮喘哮喘模型组、孟鲁司特钠组、穿山龙组、穿山龙合孟鲁司特钠组，进行分笼喂养。

2.4.2 哮喘模型制作 根据PALMANS[6]所用方法复制哮喘模型，该方法分为两个阶段：第一阶段是基础致敏，采用腹腔注射卵清蛋白；第二阶段是激发致敏，采用雾化吸入。除正常组，其余4组都进行以下操作：实验第1天，取配置好的卵蛋白氢氧化铝溶液1 mL腹腔注射(10 mg的卵蛋白与200 mg的氢氧化铝混合)，进行基础致敏；实验第8天，重复第一天的操作以加强致敏；实验第15天开始，进行激发致敏，采用2%卵蛋白生理盐水溶液进行每日一次的雾化，每次雾化30 min，连续进行20 d。正常组在实验第1天、第8天，给予腹腔注射生理盐水，第15天开始给予生理盐水雾化，给药：每天雾化前2 h，各治疗组予以对应药物进行灌胃治疗，正常组和哮喘模型组则将蒸馏水代替药物，连续灌胃20 d。除正常组外，所有大鼠在行为学观察中出现了气促、抓鼻子、点头、喜欢蜷缩、腹部可见痉挛甚至出现走路不稳等症状，说明大鼠哮喘模型制作成功。

2.4.3 标本采集 (1)血清：灌胃及雾化20 d结束后，配置2%戊巴比妥钠麻醉剂麻醉各组大鼠，取5 mL的腹主动脉血于采血管中，静置30 min离心后保存血清，用于检测各组IL-5、CysLTs的情况。(2)肺叶：采完血后迅速摘取两肺，用生理盐水清洗干净，一侧肺组织固定于提前配置好的4%多聚甲醛溶液中，显微镜下观察病理情况；将另一侧的肺组织保存在-80 ℃ 的冰箱中，测定肺叶中CysLTR1mRNA、Eot-3 mRNA的表达水平。

2.4.4 肺组织切片制作 (1)脱水：依次放置以下浓度梯度的乙醇进行脱水：70%→80%→90%→95%→100%→100%各1 h[7]。(2)透明：脱完水的肺组织置于二甲苯中约10 min，可以看出肺组织颜色变为透明。 (3)包埋：用溶化的石蜡将肺组织包埋于包埋盒中。 (4)切片：用切片机将组织切成厚度为4 μm的切片。(5)贴片：将切好的片加热熨烫后，粘到载玻片上并烘干水分，温度控制在45 ℃左右。(6)染色：脱蜡(二甲苯I 、II 各10 min)→水化(100%→100%→95%→90%→80%→70%乙醇各1 min，清水洗3 min)→苏木精染色5 min→流水冲2 min→1%盐酸乙醇分化液20 s→流水冲 5 min(变蓝)→蒸馏水洗 1 min→伊红染色3 min→流水冲30 s→脱水(80%、90%、95%、100% 乙醇各2 min)→透明(二甲苯I 、II 、Ⅲ各2 min)。(7)封片：使用中性树胶进行固定封片，最好标记，自然晾干。

2.4.5 血清中IL-5、CysLTs的检测 按照试剂盒上的说明进行操作，所有流程包括：(1)稀释→(2)加样→(3)加酶→(4)温育→(5)配液→(6)洗涤→(7)显色→(7)终止反应→(9)测定。

2.4.6 肺组织中CysLTR1和Eot-3的mRNA表达水平检测 (1)提取肺组织总RNA：匀浆管中加入Trizol Reagent预冷→放入100 mg肺组织→研磨→离心→加入250 mL三氯甲烷→静置3 min→离心→取上清新的EP管→加入异丙醇→混匀→-20 ℃环境静置15 min →离心→倒掉上清→75%乙醇1.5 mL洗涤沉淀→离心→超净台上吹3 min→加入无RNA酶的水稀释RNA→干燥RNA至乙醇完全挥发→加入DNase水溶解沉淀→OD值测定。(2)反转录：PCR管中加入10mLRNA→加入1 mL Oligo dT Primer →加入无核糖核酸酶的去离子水→PCR仪上65 ℃保温5 min→冰上冷却5 min→置于RNase PCR管中→加入4 mL 的5X Reaction Buffer、1 mL的Ribolock RNase Inhibitor、1 mL的ReverAid M-Mulv RT、2 mL的10mM dNTP Mix混合后放入65 ℃水浴中 →冰上冷却5 min。(3)实时定量PCR。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 大鼠一般情况

正常组大鼠从实验第1天到实验最后1天一般情况良好，活动自由，精神状态良好，毛发发亮，饮食正常，口咽、鼻腔无分泌物，无气促、打喷嚏。哮喘模型组和其余各治疗组大鼠均在第7天开始出现精神状态较正常组差，到实验第14天，精神状态差更为明显。雾化激发后可见呼吸急促、抓鼻子、动作不灵活、腹部出现痉挛、喜欢蜷缩、皮毛不光滑等，明显较正常组差，随着症状的加重，饮食的摄入量也随之减少。哮喘模型组在造模前和取材时体重减轻，正常组增加，体重变化有显著差异。3个治疗组进行20天的给药治疗后，症状较哮喘模型组来说有明显改善[8]。各组大鼠体质量变化：正常组和3个治疗组大鼠前后体质量变化都比哮喘模型组的变化明显(P<0.05)，其中穿山龙合孟鲁司特钠组的体质量变化最为明显。表1。

表1 各组体质量前后变化情况

3.2 肺组织HE染色病理情况

正常组：偶见少量的嗜酸性粒细胞围绕在气道和血管周围，支气管腔光滑，气道黏膜不可见，上皮结构完整，肺泡无异常。见图1。

图1 正常组

哮喘模型组：不仅在血管周围的组织中可见大量炎性细胞，在环绕肺泡壁周围也可见明显的炎性细胞；而且气道周围的血管有明显的扩张充血情况，支气管和细支气管的管腔较为狭窄，有明显的上皮细胞增生，可见增厚的平滑肌，肺间质充血水肿明显，见图2。

图2 哮喘哮喘模型组 100×

其余3组：经治疗，肺泡内炎性细胞明显少于哮喘模型组，可见轻微的支气管黏膜水肿，支气管壁内外的炎性细胞情况明显比哮喘模型组好转，其中穿山龙合孟鲁斯特钠组大鼠肺组织病理表现更接近正常组。见图3、图4、图5。

图3 穿山龙组

图4 孟鲁司特钠组

图5 穿山龙合孟鲁司特钠组

3.3 各组血清中IL-5、CysLTs水平

哮喘模型组血清中的IL-5、CysLTs水平相较正常组而言，明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；3个治疗组的血清中IL-5、CysLTs水平较哮喘模型明显降低 (P<0.05)；穿山龙合孟鲁司特钠组的相应指标水平比孟鲁司特钠组明显降低(P<0.05)，穿山龙组和孟鲁司特钠组中的IL-5水平无明显差异(P>0.05)；而穿山龙组和孟鲁司特钠组中的CysLTs水平比较，穿山龙组明显低于孟鲁司特钠组(P<0.05)，说明穿山龙降低IL-5水平的效果与孟鲁司特钠相当，但降低CysLTs水平的效果虽然不及孟鲁司特钠，但与孟鲁司特钠合用可以增强孟鲁司特钠的效果。见表2。

表2 各组血清中IL-5、CysLTs水平测定

3.4 肺组织中CysLTR1mRNA、Eot-3 mRNA表达水平

3.4.1 Eot-3mRNA表达水平 哮喘模型组的Eot-3mRNA表达水平与正常组相比，有明显升高(P<0.05)；3个治疗组中的Eot-3mRNA表达水平相对于哮喘模型组来说，明显降低，(P<0.05)；穿山龙合孟鲁司特钠组的Eot-3mRNA表达水平明显低于孟鲁司特钠组(P<0.05)，说明穿山龙可降低哮喘大鼠Eot-3mRNA的表达水平，并且与孟鲁司特钠合用，效果更好。见表3。

表3 各组Eot-3mRNA表达水平检测

3.4.2 CysLTR1mRNA表达水平 正常组中CysLTR1mRNA表达水平与哮喘模型组相比明显降低(P<0.05)；3个治疗组的CysLTR1mRNA表达水平低于哮喘模型组(P<0.05)；孟鲁司特钠组的水平明显低于穿山龙组(P<0.05)；与孟鲁司特钠组比较，穿山龙合孟鲁司特钠组的水平较低 (P<0.05)，说明穿山龙可降低哮喘大鼠CysLTR1mRNA的表达水平，并且可增加孟鲁司特钠的效果。见表4。

表4 各组CysLTR1mRNA表达水平检测

4 讨论

气道的慢性炎症是哮喘发病的根本，也就是说，无论是什么程度或类型的哮喘，气道的基本病理离不开炎症，炎症是引起哮喘气道高反应、造成气道的通气障碍并引发临床症状的关键因素[9]。根据文献报道，穿山龙不仅能促使嗜酸性粒细胞(Eos)凋亡，而且可调节Th1/Th2的平衡，从而消除气道炎症[10-12]。本实验通过对中药穿山龙与西药孟鲁司特钠作对比，经过数据分析，发现穿山龙可改善哮喘大鼠肺组织病理学状态，减轻气道中炎性细胞的浸润程度，通过对血清中IL-5、CysLTs的检测，发现穿山龙可在不同程度上降低IL-5、CysLTs水平，虽然穿山龙降低CysLTs水平的能力与孟鲁司特钠有明显差距，但是穿山龙与孟鲁司特钠合用，效果显著；并且二者合用还能降低哮喘大鼠肺组织中的CysLTR1mRNA、Eot-3mRNA表达水平，显示穿山龙能增强白孟鲁司特钠的抗炎抗喘作用。