沉默lncRNA MEG3对慢性阻塞性肺疾病小鼠肺功能的改善作用及其机制

叶婷，余维巍，张存泰

1华中科技大学同济医学院附属同济医院临床营养科，武汉 430030；

2华中科技大学同济医学院附属同济医院老年医学科

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种以肺部气流受限为主要特征的慢性、不可逆呼吸系统疾病，其临床发病率及病死率比较高，严重影响患者的生活质量［1］。既往研究显示，白细胞介素1β（IL-1β）与COPD急性加重频率、中性粒细胞计数和C反应蛋白（CRP）水平均呈正相关关系［2］。IL-1β水平升高与COPD患者NLRP3炎症小体激活以及中性粒细胞的活性密切相关，提示IL-1β与COPD患者的炎症反应有关［3］。本课题组前期也发现，COPD患者支气管肺泡灌洗液（BALF）中IL-1β水平增高，IL-1β与其肺功能呈负相关关系、与急性加重频率呈正相关关系。然而，目前关于IL-1β与COPD发生的临床前期研究均以失败告终［4］。因此，有必要深入研究IL-1β在COPD发生中的分子调控机制，发展恰当的靶向治疗手段。随着高通量测序技术日渐成熟，已有研究发现COPD患者的部分长链非编码RNA（lncRNA）出现差异表达［5］，其中lncRNA MEG3被报道参与了COPD的疾病进展过程［6］。2020年5月—2021年11月，本研究观察了沉默lncRNA MEG3对COPD小鼠肺组织、BALF中IL-1β表达及肺功能的影响，探讨lncRNA MEG3是否通过IL-1β参与COPD小鼠的肺损伤。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料实验动物：SPF级野生型雄性C57BL/6J小鼠32只，10～12周龄，体质量（24±2）g，由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供，许可证号：WYTJH（e）2019-0044。主要试剂：lncRNA MEG3 siRNA及阴性对照siRNA（NC siRNA）均购自上海吉玛基因股份有限公司，分别溶解于不含RNA的无菌水中，取适量于室温下孵育30 min，形成siRNA-Li⁃pofectamine和NC-Lipofectamine复合体（10 g/L）；小鼠IL-1β PCR试剂盒购自美国Thermo Fisher Scien⁃tific公司，IL-1β抗体购自中国武汉赛维尔生物科技有限公司，IL-1β ELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；大前门香烟（焦油10 mg、烟碱0.8 mg、CO 12 mg）购自上海卷烟厂。

1.2 COPD小鼠模型构建与分组处理将32只野生型C57BL/6J小鼠随机分成control组、COPD组、COPD+NC组、COPD+siMEG3组，每组8只。除con⁃trol组小鼠外，均采用香烟烟雾烟熏的方法建立COPD模型，方法如下：将小鼠置于自制烟熏有机玻璃舱（40 cm×30 cm×16 cm）中，全身暴露在3支香烟的烟雾中，3次/天，每次间隔30 min，共持续12周。COPD+NC组、COPD+siMEG3组 同 时 尾 静 脉 注 射siRNA-Lipofectamine、NC-Lipofectamine复 合 体2.5 mg/kg，control组、COPD组注射等量生理盐水，1次/周，共注射12次。

1.3 标本获取各组小鼠最后一次烟熏后，经4%水合氯醛腹腔注射麻醉后固定，经下腔静脉采血，静置后低温离心获得血清，-70℃保存，同时取动脉血0.2 mL用于血气分析。立即暴露气管和双肺，在气管上段作一横行切口，并夹闭左侧主支气管，用注射器经气管切口向右肺缓慢注入4 mL磷酸盐缓冲液（PBS），并进行回收（回收率85%～95%），获得BALF，重复3次；将第1次的BALF离心后取上清，-70℃保存，取其沉淀与后两次BALF混匀并离心，弃上清，再将沉淀用1 mL PBS洗涤3次，转移至1.5 mL EP管中。取出左肺，将4%多聚甲醛溶液1 mL经左主支气管注入左肺，并将其浸泡于4%多聚甲醛溶液24 h。

1.4 肺组织病理观察取各组左肺下叶组织，常规进行脱水、石蜡包埋、切片，HE染色后显微镜下观察肺组织病理学改变。

1.5 动脉血氧合相关指标检测取各组小鼠动脉血0.2 mL进行血气分析，检测氧分压（PaO2）、二氧化碳分压（PaCO2）和pH，并计算氧合指数。

1.6 肺湿重/干重测定取各组小鼠左肺上叶组织，称其湿重后置于80℃烘箱中烘烤24 h，称其干重，计算肺湿重/干重。

1.7 lncRNA MEG3与IL-1β的 靶 控 关 系 分 析JASPER数据库预测lncRNA MEG3与IL-1β之间存在结合位点（OSID码图1A、B）。进行染色质免疫共沉淀实验：收集1×108个气道上皮细胞，使用3%的甲醛交联细胞10 min，加入1.5 mmol/L Glycine终止交联反应；依次裂解细胞膜和细胞核，使用超声将细胞核中的DNA片段剪切到250 bp左右；将超声后的DNA片段离心后取上清，加入钙调蛋白2抗体5 μg孵育过夜；以对应种属的IgG作为阴性对照，提取DNA进行荧光定量PCR检测，证实lncRNA MEG3与IL-1β启动子区域存在结合位点，提示二者存在靶控关系（OSID码图1C）。

1.8 肺 组 织 及BALF中lncRNA MEG3、IL-1β mRNA检测采用实时荧光定量PCR法。取各组肺组织及BALF，TRIzol法提取总RNA，测定浓度后按照试剂盒说明书逆转录为cDNA，采用SYBR-GreenⅠReal-time PCR Kit进行PCR反应。lncRNA MEG3引物序列：上游引物5'-ACCTCGTGTGGGGAAA⁃GATCA-3'，下 游引 物5'-CCATCGCCAAACCACTG⁃GA-3'；IL-1β引物序列：上游引物5'-CCGCAGCCTA⁃CATCATTC-3'，下游引物5'-CGCCATAAGCCCTCC⁃TA-3'；内参GAPDH引物序列：上游引物5'-AGGTC⁃GGTGTGAACGGATTTG-3'，下游引物5'-TG⁃TAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'。采 用2-ΔΔCt法 计算目的基因相对表达量。

1.9 肺组织及BALF中IL-1β蛋白检测取各组肺组织及BALF，参照IL-1β ELISA试剂盒说明书检测肺组织及BALF中的IL-1β蛋白表达，严格按照试剂盒说明书操作。

1.10 统计学方法采用GraphPad Prism 9.0统计软件。计量资料采用Kolmogorov-Smirnov正态性检验，呈正态分布以±s表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，重复测量数据采用重复测量的方差分析；非正态分布以M（P25，P75）表示，组间比较采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠肺组织病理情况比较control组小鼠肺组织完整，未见明显的炎症细胞浸润，无明显肺泡水肿及结构破坏，支气管平滑肌层及管壁结构完整无明显异常；COPD组及COPD+NC组小鼠肺泡结构紊乱，部分肺泡可见不规则扩大，肺泡、小气道及肺血管可见大量炎症细胞浸润；COPD+siMEG3组小鼠肺泡结构较COPD组及COPD+NC组完整，肺泡、小气道和肺血管少量炎症细胞浸润，支气管平滑肌层及管壁结构偶见异常。见OSID码图2。

2.2 各组小鼠氧合指数和肺湿重/干重比较见表1。

表1 各组小鼠氧合指数和肺湿重/干重比较（±s）

表1 各组小鼠氧合指数和肺湿重/干重比较（±s）

注：与control组比较，*P<0.05；与COPD组、COPD+NC组比较，#P<0.05。

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2.3 各组小鼠肺组织、BALF中lnc RNA MEG3及IL-1β mRNA、蛋白比较见表2。

表2 各组小鼠肺组织、BALF中lnc RNA MEG3及IL-1β mRNA、蛋白表达比较（±s）

表2 各组小鼠肺组织、BALF中lnc RNA MEG3及IL-1β mRNA、蛋白表达比较（±s）

注：与control组比较，*P<0.05；与COPD组、COPD+NC组比较，#P<0.05。

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3 讨论

炎症一直以来都是COPD发病机制的研究重点，吸烟是COPD慢性持续炎症反应的主要诱因，但部分COPD患者戒烟后肺部炎症反应却持续进展，进一步探索炎症反应的相关机制十分必要。既往研究证实，IL-1β明确参与了COPD的发生发展［7］。IL-1β信号传导与香烟烟雾和感染引起的慢性炎症、气道重塑和肺气肿有关，并且与几乎所有已知的COPD相关介质和疾病过程相互作用或影响［8］。研究显示，IL-1β是COPD发病过程中肺上皮—间质单位（EMTU）中上皮—成纤维细胞通讯紊乱的主要驱动因素［9］。COPD小鼠肺上皮细胞及巨噬细胞中IL-1β高表达，导致强烈的炎症反应，并伴有肺气肿和气道重塑［10］；IL-1β与IL-1R1结合形成IL-1R1复合物，通过经典Toll白细胞介素受体（TIR）/骨髓分化初级反应基因88（MyD88）途径激活信号传导，该通路特异性地导致转录因子的核转位，例如p38丝裂原相关蛋白激酶、c-Jun N-末端激酶、激活蛋白1和NF-κB，可促进多种炎症细胞因子和生长因子的表达［11］。然而，IL-1β拮抗剂在临床上却未成功转化为COPD的治疗方案，究其原因如下：①未使用IL-1β特异性拮抗剂；②IL-1β拮抗剂的使用时机不清楚；③无法判断IL-1β拮抗剂在肺组织中是否达到合适的血药浓度；④COPD中存在不同的表型，尚缺乏针对不同表型的研究方案［12］。上述因素可能制约了IL-1β拮抗剂的临床应用，同时目前亦缺乏对IL-1β相关信号通路的了解，可能无法从单一途径来阻断IL-1β的致炎作用，需要对IL-1β的上游信号通路进行进一步研究［4］。本研究进一步证实，吸烟所致COPD小鼠的肺组织及BALF中存在IL-1β mRNA及蛋白表达升高，可能参与了COPD小鼠的炎症反应。

为了探索了IL-1β的上游信号通路，本研究通过RPIseq数据库预测了lncRNA MEG3与IL-1β启动子的潜在作用位点；通过染色质免疫共沉淀实验验证lncRNA MEG3与IL-1β启动子上存在结合位点，提示lncRNA MEG3可能通过影响IL-1β启动子来调节IL-1β的表达。本研究结果显示，敲减lncRNA MEG3可以改善COPD小鼠的肺组织病理及肺功能，并且对IL-1β表达具有调控作用。既往研究显示，lncRNA MEG3在COPD患者肺组织中表达上调，与第一秒用力呼气量占所有呼气量的比例呈负相关关系，敲减lncRNA MEG3可减轻香烟烟雾诱导的肺上皮细胞凋亡、炎症反应及细胞毒性［13］。与本研究结果一致。lncRNA MEG3还可能通过调节p53、NF-кB的表达介导人支气管上皮细胞凋亡和自噬等，我们进一步探索了lncRNA MEG3对下游炎症因子IL-1β的调控效应，证实了lncRNA MEG3在COPD发生发展中具有重要作用。研究显示，在COPD患者的肺组织和经香烟烟雾提取物（CSE）处理的16HBE细胞中lncRNA MEG3表达上调。本研究结果显示，与control组比较，COPD组肺湿重/干重升高，氧合指数降低，肺组织lncRNA MEG3表达升高且肺组织、BALF中IL-1β mRNA、蛋白均升高，提示COPD小鼠存在明显肺损伤及lncRNA MEG3、IL-1β表达升高；与COPD组比较，COPD+siMEG3组肺湿重/干重降低，氧合指数升高，肺组织lncRNA MEG3表达降低且肺组织、BALF中IL-1β mRNA、蛋白均降低，提示沉默lncRNA MEG3可通过降低IL-1β表达而减轻COPD小鼠的肺损伤。

综上所述，COPD小鼠肺组织及BALF中lncRNA MEG3及IL-1β表达均升高，lncRNA MEG3可能通过结合IL-1β启动子区上调IL-1β表达，从而促进气道炎性损伤，加速COPD的病理进程；沉默lncRNA MEG3可通过降低IL-1β表达而减轻COPD小鼠的肺损伤，从而发挥肺保护作用。但是本研究在小鼠BALF中未检测到lncRNA MEG3表达，提示lncRNA MEG3可能是通过组织水平调节IL-1β表达，lncRNA MEG3是否能够调控IL-1β相关炎症通路，以及具体的调控机制仍需进一步研究。