不同絮凝剂对光合细菌采收的影响

易建华， 胡骏鹏， 覃先武， 戴晋军，王 辉， 宋庆洋， 王 钦*

（1.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443003；2.湖北省酵母功能湖北省重点实验室，湖北宜昌 443003）

光合细菌（PSB）是具有原始光能合成体系的原核生物的总称，其广泛存在于水田、湖泊、江河、海洋、活性污泥及土壤内，是一类以光作为能源，在厌氧光照或好氧黑暗条件下，利用有机物、硫化物、氨等作为供氢体兼碳源进行光合作用的微生物（Lami等，2007；Kelley等，1978）。光合细菌体内富含生物素、蛋白质、多种维生素、辅酶Q、类胡萝卜素等生理活性物质（Wang等，2017），广泛用于农业领域，可以促进动植物生长，增强抗病机能，减少疾病发生，提高生物存活率（Su等，2017；曹琛，2010；肖永清，2002）。光合细菌通过光合作用将废弃有毒物质转化为自身所需营养，能够净化水质和改善环境。研究表明，光合细菌在医药、食品、制氢等领域有广泛的应用前景（郭庆华和戴奕杰，2018；王飞等，2010；Basak等，2007）。

由于光合细菌菌体体积小、培养液密度低，导致菌体回收难，极大地限制了光合细菌的市场发展（Hülsen，2018；何剑丹，2005）。与传统的离心技术相比，絮凝技术作为一种相对耗能少、成本低、操作简单的适合于大规模采收的技术，正逐渐受到研究者的关注（Fasaei等，2018；张同迁，2018）。何丹等（2020）使用1900 mg/L氯化铁絮凝光合细菌菌液静置10 min，絮凝回收率达到最大，为（99.99±0.01）%；使用1500 mg/L硫酸铝絮凝光合细菌菌液静置10 min，絮凝回收率达到最大，为（98.24±0.01）%。黄业翔等（2018）研究发现，使用聚合氯化铝质量浓度为1800 mg/L絮凝光合细菌时接近70%光合细菌絮凝沉淀。张秀霞等（2020）研究发现，酵母对光合细菌有一定絮凝沉降效果。何丹等（2020）使用0.008 g/L壳聚糖絮凝光合细菌，絮凝回收率达到（84.20±0.02）%。本研究比较5种絮凝剂对光合细菌的絮凝效果，确定适宜的絮凝剂及其适宜浓度与絮凝时间。通过絮凝沉降试验，探讨不同絮凝剂的沉降效果，旨在筛选安全、高效、低成本的絮凝剂，为光合细菌的采收工艺研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂 配养基：乙酸钠3.0 g/L、硫酸铵1.0 g/L、氯化钠1.0 g/L、硫酸镁0.2 g/L、氯化钙0.05 g/L、磷酸二氢钾0.3 g/L、磷酸氢二钾0.5 g/L、酵母膏0.1 g/L和微量元素。所用菌种购自广东微生物菌种保藏中心的荚膜红细菌Rhodobacter capsulatus（保藏号：GDMCC 1.168）。光合细菌所用培备液1 mL。其中微量元素贮备液的基本成分：乙二胺四乙酸二钠2 g/L、硫酸亚铁0.2 g/L、氯化锰0.1 g/L、硼酸0.1 g/L、氯化钴0.1 g/L、氯化锌0.1 g/L、硫酸铜0.1 g/L。絮凝剂：硫酸铝、聚合氯化铝、硫酸亚铁、氯化铁，上海麦克林生化科技有限公司生产。所有试剂均为分析纯；酵母细胞壁（改性型）由安琪酵母股份有限公司生产。

1.2 仪器与设备 实验室pH计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司生产；精密电子天平，赛多利科学仪器（北京）有限公司生产；YXQ-LS-50SII立式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂生产；HYL-A全温摇瓶柜，太仓市强乐实验设备有限公司生产；Multiskan FC型酶标仪，赛默飞世尔（上海）仪器有限公司生产；SWCJ-2FD型双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司生产；78HW-1数显恒温磁力搅拌器，杭州仪表电机有限公司生产。

1.3 光合细菌培养 光合细菌培养基121℃，灭菌15 min，按20%接种量接种光合细菌菌液，于30℃、光强2500 Lux的智能光照培养箱中培养72～96 h，测OD660nm值为0.8～1.0，备用。

1.4 絮凝剂沉降试验 通过试验测定了无机硫酸铝、聚合氯化铝、硫酸亚铁、氯化铁及酵母细胞壁5种絮凝剂对光合细菌的絮凝效果。絮凝剂加入在100 mL PSB菌液充分混匀，絮凝剂浓度为500、1000、1500、2000 mg/L的无机硫酸铝，或聚合氯化铝，或硫酸亚铁，或氯化铁，或酵母细胞壁。在不同静置时间测定OD660值，计算絮凝率。每个试验平行测定3次。

絮凝率Y/%=（OD0混合均匀菌液OD660-ODt上清液OD660）/OD0混合均匀菌液OD660×100。

式中：Y为絮凝率；OD0为原始菌液OD值；ODt为静置t时间的OD值。

1.5 数据处理 各组数据用“平均数±标准差”表示，统计分析采用邓肯式多重比较法。

2 结果与分析

2.1 氯化铁质量浓度对光合细菌絮凝回收率的影响 由图1可知，光合细菌菌液中添加聚合氯化铝后，菌液迅速形成絮状物并开始分层，絮状物快速聚集沉降，随着氯化铁浓度的增加，上清液颜色越来越淡，沉降菌液体积越来越大。对单一质量浓度而言，在静置1 h左右时絮凝效果趋于稳定，此后回收率几乎不再发生变化。氯化铁的质量浓度对光合细菌的回收率有显著影响（P＜0.05）。随氯化铁质量浓度升高，回收率先升高后趋于稳定。当氯化铁质量浓度为500 mg/L时，回收率最低，为（83.61±0.64）%；随着氯化铁质量浓度的增加，光合细菌回收率逐渐增加；当氯化铁质量浓度为1000 mg/L时达到最高回收率，为（98.10±0.24）%。因此，以氯化铁为絮凝剂时，质量浓度为1000 mg/L时最佳。

图1 氯化铁质量浓度对光合细菌絮凝率的影响

2.2 硫酸铝质量浓度对光合细菌絮凝回收率的影响 由图2可知，光合细菌菌液中加入硫酸铝，迅速形成较大块的絮凝物，絮凝物或沉于底部或悬浮于液体中。对单一质量浓度而言，在静置时间1 h时趋于絮凝效果稳定，此后回收率几乎不再发生变化。硫酸铝质量浓度对光合细菌的回收率有显著影响（P＜0.05）。硫酸铝质量浓度越大，回收率先增大后减小。当硫酸铝质量浓度为500 mg/L时，回收率仅为（81.88±0.81）%；硫酸铝质量浓度为1000 mg/L时达最高回收率，增加到（94.12±0.13）%；继续增加硫酸铝的质量浓度1500～2000 mg/L，光合细菌的回收率显著降低85.62%～66.42%。因此以硫酸铝为絮凝剂时，质量浓度为1000 mg/L时最佳。

图2 硫酸铝质量浓度对光合细菌絮凝率的影响

2.3 硫酸亚铁质量浓度对光合细菌絮凝回收率的影响 由图3可知，光合细菌菌液中加入硫酸亚铁后形成絮状物，有一些小絮状物悬浮于菌液中但不沉降。对单一质量浓度而言，在静置时间1 h时趋于絮凝效果稳定，此后回收率几乎不再发生变化。硫酸亚铁的质量浓度对光合细菌的回收率有显著影响（P＜0.05）。随硫酸亚铁质量浓度升高，回收率先升高后趋于稳定。当硫酸亚铁质量浓度为500 mg/L时，回收率最低，为（80.19±0.13）%；随着硫酸亚铁质量浓度的增加，光合细菌回收率逐渐增加；当硫酸亚铁质量浓度为1500 mg/L时达到最高回收率，为（90.56±0.16）%。因此以硫酸亚铁为絮凝剂时，质量浓度为1500 mg/L时最佳。

图3 硫酸亚铁质量浓度对光合细菌絮凝率的影响

2.4 酵母细胞壁质量浓度对光合细菌絮凝回收率的影响 由图4可知，光合细菌菌液中添加酵母后，菌液形成絮状物并开始分层，絮状物聚集沉降，随着酵母细胞壁浓度的增加，上清液颜色越来越淡，沉降菌液体积越来越大。对单一质量浓度而言，在静置时间1 h时趋于絮凝效果稳定，此后回收率几乎不再发生变化。酵母细胞壁的质量浓度对光合细菌的回收率有显著影响（P＜0.05）。酵母细胞壁质量浓度越大回收率越高。当酵母细胞壁质量浓度为20 mg/L时，回收率最低，为（20.68±0.34）%；随着酵母细胞壁质量浓度的增加，光合细菌回收率逐渐增加；当酵母细胞壁质量浓度为80 mg/L时达到最高回收率，为（77.65±0.33）%。因此以酵母细胞壁为絮凝剂时，质量浓度为80 mg/L时最佳。

图4 酵母细胞壁质量浓度对光合细菌絮凝率的影响

2.5 聚合氯化铝质量浓度对光合细菌絮凝回收率的影响 由图5可知，光合细菌菌液中添加聚合氯化铝后，菌液迅速形成絮状物并开始分层，絮状物快速聚集沉降，随着聚合氯化铝浓度的增加，上清液颜色越来越淡，沉降菌液体积越来越大。对单一质量浓度而言，在静置时间1 h时趋于絮凝效果稳定，此后回收率几乎不再发生变化。聚合氯化铝的质量浓度对光合细菌的回收率有显著影响（P＜0.05）。聚合氯化铝质量浓度越大回收率越高。当聚合氯化铝质量浓度为500 mg/L时，回收率最低，为（42.41±0.45）%；随着聚合氯化铝质量浓度的增加，光合细菌回收率逐渐增加；当聚合氯化铝质量浓度为2000 mg/L时达到最高回收率，为（70.83±0.44）%。因此以聚合氯化铝为絮凝剂时，质量浓度为2000 mg/L时最佳。

图5 聚合氯化铝质量浓度对光合细菌絮凝率的影响

3 讨论

光合细菌常规条件下自然沉降困难，导致固液分离困难，影响菌体资源回收。目前，光合细菌采收工艺主要是高速离心和絮凝沉淀（Fasaei等，2018；梁志华和王梦亮，2010）。Fasaei等（2018）研究表明，絮凝技术相对耗能少、成本低、操作简单，适于大规模采收。因此，本试验采用了相对较好的絮凝技术进行光合细菌采收。

无机絮凝剂会在水中发生水解反应生成中间产物，水中的光合细菌细胞在中间产物的作用下进行吸附电中和、吸附架桥或吸附卷扫等作用，通过这些相互作用生成粗大的絮凝体，从而沉降下来（田玲等，2004）。该试验中，氯化铁、氯化亚铁、硫酸铝和聚合氯化铝加入光合细菌菌液后，在水中与光合细菌菌体所带的负电荷瞬间产生中和作用而迅速絮凝，并进一步架桥生成大絮团而快速沉降。使用无机和有机絮凝剂，首先是用量大，其次还需要对残留物及其副产物进行进一步无毒无害化处理，导致其在生产生活中的应用受到了限制。因此，对絮凝剂的研究转变成向着无毒害化方向发展。由于生物絮凝剂可以克服无机和有机絮凝剂本身的缺陷，零排放，对环境几乎不存在污染现象，因此，生物絮凝剂成为研究的热点（封培等，2009）。酵母细胞壁是从酵母的细胞壁中提取出来的一些大分子糖类聚合物，内层为葡聚糖层，中间层主要由蛋白质组成，外层为甘露聚糖层，这种特殊的结构促进絮凝剂快速形成稳定的絮体从而絮凝光合细菌。

试验研究表明，硫酸铝、聚合氯化铝、硫酸亚铁、氯化铁及酵母细胞壁5种絮凝剂对光合细菌均有较好的絮凝效果。氯化铁添加量为1000 mg/L时，1 h的絮凝率即可达到（98.10±0.24）%。该结果与何丹等（2020）研究结果相类似。氯化铁对光合细菌絮凝效果显著高于硫酸铝。陈亚松（2011）研究表明，铁系絮凝剂较铝系絮凝剂对光合细菌等微生物的抑制作用小，更适合用来絮凝光合细菌等微生物。同属铁系絮凝剂硫酸亚铁的絮凝采收能力却不及氯化铁，由于氯化铁中铁离子在水中会生成氢氧化铁胶体来絮凝光合细菌，硫酸亚铁中亚铁离子氧化生成铁离子，进而水解成氢氧化铁胶体达到絮凝光合细菌（严言正，1986）。聚合氯化铝的絮凝效果较其他4种絮凝剂絮凝效果表现不佳，当聚合氯化铝质量浓度为2000 mg/L时达到最高回收率，仅为（70.83±0.44）%，这与黄业翔等（2018）的研究结果相类似。张秀霞（2020）研究了不同絮凝剂聚合氯化铝、聚丙烯酰胺阳离子型和阴离子型、酵母对沼泽红假单胞菌絮凝效果，结果表明2000 mg/L聚合氯化铝的光合细菌絮凝采收率可以达到（96.86±0.01）%；闫海等（2015）研究了不同铝盐如硫酸铝、明矾、氯化铝和聚合氯化铝采收沼泽红假单胞菌，结果发现，0.01 mol/L聚合氯化铝几乎能够絮凝培养液中全部的光合细菌细胞。与其他絮凝剂相比，酵母细胞壁的质量浓度为80 mg/L时回收率最高，可达（77.65±0.33）%。酵母细胞壁不仅市场价格相比于硫酸铝、聚合氯化铝、硫酸亚铁、氯化铁较低，而且不像铝盐和铁盐对生物有害，絮凝得到的菌体之间结合更紧密，更利于菌水分离。

4 小结

本试验结果表明，硫酸铝、聚合氯化铝、硫酸亚铁、氯化铁及酵母细胞壁5种絮凝剂均能高效回收光合细菌，其中酵母细胞壁更适于用来絮凝光合细菌，且适宜的质量浓度为80 mg/L，时间为1 h。