半滑舌鳎肠道中抗氧化活性乳酸杆菌的筛选与鉴定

郭 东， 包瑞璇， 王 逸， 卢 静， 吕明生*， 王淑军

（1.江苏海洋大学海洋生物资源与环境重点实验室/海洋生物技术重点实验室，江苏海洋大学，江苏连云港 225005；2.江苏省海洋生物产业技术协同创新中心，江苏连云港 222000）

半滑舌鳎鱼（Cynoglossus semilaevis）属于舌鳎属，经中国水产研究院黄海研究所成功训化后，是我国重要水产养殖品种之一（张馨馨，2021）。鱼体内脂肪中含有丰富的不饱和脂肪酸，具有防止动脉粥样硬化、防治心血管疾病、增强记忆力和防止视力衰退等功效（张永真等，2016；王娜，2010）。该种鱼多产于我国渤海湾、胶州湾和海州湾等海域（孙中之等，2005），近年来随着养殖数量的增加，腹水病、烂鳍病、肠炎病等疾病经常发生（苏兆军，2015）。水产养殖中急需有效的病害防控措施。

乳酸菌是水产养殖中重要的微生态菌种之一，通过产生有机酸、乳酸菌素等提高养殖动物抵抗力（巩华等，2018）。研究发现，乳酸菌和发酵产物还具有抗氧化作用。通过在饲料中添加具有抗菌和抗氧化作用的乳酸菌，可以实现健康养殖（曹卫华，2017）。本研究从半滑舌鳎鱼肠道中筛选乳酸菌，并对其生长特性、抑菌作用、抗氧化活性以及其对饲料脂质抗氧化作用进行了研究，拟为获得的乳酸菌的应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 原材料 健康的半滑舌鳎鱼：水产品养殖场；高脂半滑舌鳎鱼饲料：通威股份；创伤弧菌、大肠杆菌、副溶血弧菌、维氏气单胞菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、库氏链霉菌、拟杆菌、嗜水气单胞菌等指示菌株：江苏海洋大学海洋资源与环境重点实验室。

1.1.2 试剂与培养基 胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K：购于南京都莱生物技术有限公司；过氧化氢酶：购于上海阿拉丁试剂；革兰氏染色试剂盒：购于北京索莱宝科技有限公司；DNA marker2000、DNA marker5000：购自Takara-宝日医生物技术（北京）有限公司；电泳用琼脂糖：购于BIOWEST公司；细菌DNA基因组提取试剂盒：购于生工生物工程（上海）股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：Sigma公司；MRS肉汤：北京陆桥技术股份有限公司。

1.1.3 仪器设备 1510酶标仪：美国Thermo公司；SPX-150B-Z生化培养箱：上海博讯实业有限公司；XN-26高速冷冻离心机：美国Beckman Coulter公司。

1.2 试验方法

1.2.1 乳酸菌鉴定

1.2.1.1 革兰氏染色 将培养10 h的菌株进行革兰氏染色鉴定。

1.2.1.2 16SrDNA鉴定 将革兰氏染色阳性的菌株提取基因组，选用细菌鉴定通用引物，经提取菌株基因组，PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测后寄上海生工生物公司检测，测序结果与GenBank数据库比对后绘制系统进化树（高鹏，2016；吕爱军等，2010）。

1.2.2 乳酸菌对病原菌的抑制 采用牛津杯法。将分离菌株接种MRS液体培养基，37℃，48 h，取部分发酵液7300×g，4℃离心30 min（郭凤茹，2019；Komora等，2017）。选取创伤弧菌、大肠杆菌、副溶血性弧菌、哈维氏菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、库氏链霉菌、拟杆菌和嗜水气单胞菌活化后，稀释涂布于LB培养基，灭菌牛津杯放置涂菌培养基表面加入200μL发酵上清液，37℃，24 h，测定抑菌圈直径。

1.2.3 乳酸菌生长特性

1.2.3.1 耐酸性 将菌株接种于用1 mol NaOH和1 mol的HCl调节pH至2.0和3.0的MRS液体培养基中，37℃培养，分别于0、2、4、6 h取样测定发酵液OD600（杜金城等，2016；Pakarian等，2016），不调节pH的MRS培养基为对照。

1.2.3.2 耐胆盐 在MRS液体培养基添加0、0.1%、0.3%、0.5%的胆盐（杜金城等，2016；郝志明等，2006）。接种菌株，37℃培养，分别于0、2、4、6 h取样测定发酵液OD600。

1.2.4 抗生素对乳酸菌生长的影响 采用药敏纸片扩散法。菌株100μL菌液涂布MRS培养基，放置数分钟，选用硫酸卡那霉素、氨苄青霉素、硫酸链霉素和氯霉素四种抗生素，药敏试纸含抗生素量为10μg/mL。将药敏试纸分别放置于培养基，37℃培养24 h（任士菊等，2014；Newaj-Fyzul等，2014），测定抑菌圈直径。

1.2.5 抑菌物质的鉴定 分别检测过氧化氢酶、蛋白酶、pH、加热处理和超滤对抑菌物质活性的影响，采用牛津杯法，测定上清液抑菌圈的大小（马迎涛，2016；Ngo，2015）。

1.2.5.1 过氧化氢酶 调节菌株发酵上清液至过氧化氢酶的最适pH 7.0，加入浓度为5 mg/mL的过氧化氢酶，37℃处理2 h，处理后调节pH与对照上清液相同。

1.2.5.2 蛋白酶 菌株发酵上清液分别加入胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶，使其终浓度为5 mg/mL，分别在酶的最适温度和pH条件下2 h，将上清液pH调至与对照组相同（Papagianni，2015）。

1.2.5.3 pH 菌株发酵上清液的pH调节至3.0、5.0、7.0、9.0，对照为未调节pH。

1.2.5.4 加热处理 菌株发酵上清液置于60、80、100℃条件下处理15 min，未处理的上清液为对照（迟海等，2020）。

1.2.5.5 超滤 检测活性物质的分子量。选用3、10、30、50 K和100 K超滤管，取5 mL发酵上清液超滤，4℃，2400×g离心后，取200μL，采用牛津杯法检测。指示菌为副溶血弧菌、嗜水气单胞菌。

1.2.6 乳酸菌发酵液的抗氧化活性 菌株发酵上清液、菌悬液及无细胞提取物（CFE）的制备（Li等，2013；Chen等2008）。菌株以1%接种MRS液体培养基，于37℃培养16 h。（1）发酵液4℃条件下，7300×g离心30 min，收集上清液和菌体；（2）菌体经PBS缓冲液洗3次，调整浓度为1.0×1010cfu/mL菌悬液；（3）取部分菌体超声（1500 W，10 min）破碎，4℃，7300×g离心30 min，上清液为CFE。

1.2.6.1 超氧阴离子自由基的清除能力 在含有0.05 mol的Tris-HCl缓冲液（pH 8.0，4.5 mL）和2.5mol的邻苯三酚0.4 mL溶液中加入样品100μL，置于25℃恒温水浴中放置8 min，立即滴加一滴8 mol HCl终 止反应 （余芳等，2017；Box等，2014）。在325 nm波长测定吸光度。样品的吸光度：A1，生理盐水代替样品：空白对照A0。

超氧阴离子自由基清除率/%=（A0-A1）/A0×100。

1.2.6.2 羟自由基（·OH）的清除能力 在试管中加入的FeSO4溶液（5 mol）2 mL，C7H6O3-C2H5OH（5 mol）2 mL，H2O2溶液（3 mol）2 mL，混合均匀，加入3 mL样品，37℃保温20 min，在4℃，7300×g离心10 min，上清液测定OD510数值为Aβ。以无菌生理盐水代替H2O2为空白，测定的吸光度数值为Aα；生理盐水代替样品为对照，测定的吸光度数值为Aε（Das等，2015）。

·OH自由基的清除率/%=[1-（Aβ－Aα）]/Aε×100。

1.2.6.3 DPPH自由基的清除能力 试管中加入样品和含有0.2 mol DPPH的无水乙醇溶液各2 mL，混均后避光静置30 min，4℃，7300×g离心10 min，取上清液测定OD517数值为Aγ。空白不含DPPH，记为Aθ，对照为无菌水，记为AΩ（黄玉军，2013）。

DPPH自 由 基 清 除 率/%=[1-（Aγ－Aθ）]/AΩ×100。

1.2.6.4 还原能力 玻璃试管加入样品、K3[Fe（CN）6]（1%）、pH 6.6的PBS缓冲液各1 mL，混合均匀后（姚杰玢等，2015），50℃保温15 min，降至室温后加入1 mL的10%体积的C2HCl3O2，混匀，于4℃，7300×g离心10 min。取上清液、纯水和三氯乙酸试剂（0.1%）各2 mL，充分混匀，静置5min后 测 定OD700（Mikulski等，2020；Wang，2020）。样品的吸光度值为Aa，以PBS缓冲液代替样品的吸光度值为Ab。

还原能力/%=（Aa-Ab）/Ab×100。

1.2.7 抗脂质过氧化 取250 g高脂质半滑舌鳎鱼饲料样品碾碎成粉末，加入50 mL培养16 h的菌悬液或发酵上清液，拌匀，空白对照不加。于60℃条件下放置24 h后取出放入500 mL锥形瓶中，加入适量石油醚浸没样品，静置24 h后过滤，置于45℃烘箱内干燥2 h，参考伍立锋等（2011）的方法测OD572并绘制标准曲线计算过氧化值。

1.3 数据分析 采用三组平行试验设计，利用Origin 2021进行作图，应用IBM SPSS Statistics 26进行数据处理与统计，MEGA 7.0绘制系统发育树。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌鉴定

2.1.1 革兰氏染色结果 经过多轮筛选，共获得有透明圈的菌株32株。经革兰氏染色、芽孢染色和鞭毛染色观察。其中，菌株CS1、CS2、CS4为革兰氏阳性，杆菌、无芽孢、无鞭毛、菌端钝圆。结果见图1。

图1 菌株CS1、CS2、CS4革兰氏染色结果

2.1.2 菌株16SrDNA的序列分析 三株菌16S rDNA的PCR产物的琼脂糖电泳见图2，产物大小约为1500 bp。经上海生工进行测序、比对，构建的系统进化树见图3、图4、图5。

图2 16S rDNA PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果

图3 菌株CS1系统进化树

图4 菌株CS2系统进化树

图5 菌株CS4系统进化树

菌株CS1和CS2与发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）的同源性为99%；CS4与植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的同源性为98%，确定三菌株分另为Lactobacillus sp.CS1，Lactobacillus sp.CS2，Lactobacillus sp.CS4。

2.2 菌株对病原菌生长的影响 菌株发酵上清对病原菌生长的影响见表1。菌株CS1对大肠杆菌、维氏气单胞菌、副溶血弧菌、枯草芽孢杆菌抑菌能力最强，对库氏链霉菌、拟杆菌、嗜水气单胞菌和金黄色葡萄球菌抑制能力次之，对霍乱弧菌以及创伤弧菌则无明显的抑制作用。菌株CS2和CS4对维氏气单胞菌的抑菌能力最强，对创伤弧菌、霍乱弧菌以及幽门螺旋杆菌则无抑制作用，对其余菌株均有不同程度的抑制作用。结果表明，菌株的上清液可抑制病原菌生长，具有广谱抑菌效果。

表1 菌株上清液的抑菌圈直径结果

2.3 菌株的生长特性

2.3.1 耐酸性研究结果 菌株CS1、CS2、CS4在pH 2～3条件下均可生长，生长速率略有降低（图6）。该特性有利于菌株在肠道中的定植。

图6 菌株CS1、CS2、CS4在不同pH条件下的生长曲线

2.3.2 耐胆盐研究结果 从图7可以看出，在0.1%胆盐浓度条件下，菌株CS1、CS2、CS4均可正常生长。随着胆盐浓度的增加，对菌株CS1、CS2、CS4的生长有一定影响。在0.5%胆盐条件下，菌株的生长速率较正常条件降低40%左右。肠道中胆盐可以抑制微生物的生长，菌株在不同胆盐条件下的生长特性有利于其成为肠道优势菌。

图7 菌株CS1、CS2、CS4在不同浓度胆盐下的生长曲线

2.4 药敏试验 由表2可知，氨苄青霉素钠、氯霉素对乳酸菌的生长有显著的抑制性，显示出清晰的抑菌圈，而菌株CS1、CS2、CS4对硫酸链霉素和硫酸盐卡那霉素则不敏感。

表2 乳酸菌对抗生素的耐药性

2.5 抑菌物质活性研究

2.5.1 排除过氧化氢试验结果 由表3可以看出，经过氧化氢酶处理后的上清液，菌株CS1、CS2、CS4的抑菌圈略有下降，但差异不显著。结果表明，乳酸菌不是通过产生H2O2抗菌的。

表3 乳酸菌上清液排除过氧化氢试验结果

2.5.2 蛋白酶对抑菌物质活性影响的试验结果由表4可知，经蛋白酶K处理后，没有抑菌活性，经胰蛋白酶处理后，抑菌活性显著降低。木瓜蛋白酶和胃蛋白酶对上清液的抑菌作用没有影响。推测上清液中抑菌成分为蛋白质，这与王腾腾（2017）从许氏平鲉肠道中分离的乳酸菌的结果相似。

表4 乳酸菌上清液验证蛋白性试验结果

2.5.3 pH对抑菌物质活性的影响 由表5可见，在酸性条件下，菌株CS1、CS2、CS4的发酵上清液对指示菌株的抑制能力没有显著差异；在中性条件下，抑菌能力下降；碱性条件时，抑菌能力丧失。

表5 pH对乳酸菌上清液抑菌的影响

2.5.4 抑菌物质热稳定性研究试验结果 菌株CS1、CS2、CS4发酵上清液经不同温度处理后，其抑菌能力均未有显著变化（表6），表明抑菌物质具有较强的耐高温能力，短时间在高温条件下处理，其抑菌能力不受影响。

表6 乳酸菌上清液热稳定性影响的试验结果

2.6 抑菌物质的抗氧化活性

2.6.1 对超氧阴离子自由基（O2-）的清除能力 由图8可见，三株试验菌株的上清液对超氧阴离子的清除能力最强，其中，菌株CS1最强达到（29.8±2.41）%，高于菌株CS2与CS4。三株菌株的无细胞提取物的清除能力弱，表明抗氧化物主要为菌株发酵的胞外产物。与刘洋等（2012）的研究结果相同。

图8 对超氧阴离子的清除结果

2.6.2 对羟自由基（·OH）的清除能力 由图9可知，菌株CS1、CS2、CS4的发酵上清液对羟基自由基的清除能力最强，菌悬液次之，无细胞提取物对羟基自由基的清除能力最弱；不同菌株间，CS2的上清液较其他菌株清除能力较强，达 （35.0±1.54）%；对羟基自由的的清除能力强弱则体现了该物质抗氧化能力的大小。

图9 对羟基自由基的清除结果

2.6.3 对DPPH自由基的清除能力 菌株的发酵上清液对DPPH清除能力最强，其中，菌株CS1达到（52.6±4.10）%，最弱的是菌株CS2，清除能力为（41.7±1.55）%。菌悬液的DPPH清除能力次之，无细胞提取物清除能力最弱。

图10 对DPPH自由基的清除结果

2.6.4 菌株发酵液的还原能力 从图11可以看出，菌株发酵上清液的还原能力最强，其中，菌株CS2为（27.5±3.12）%，明显高于其他两株菌株。从菌悬液的角度，菌株CS4的还原能力最强，为（20.3±2.35）%，甚至高于其自身上清液。

图11 菌株发酵液还原性试验结果

2.7 活性物质分子量估算 选取嗜水气单胞菌和副溶血弧菌作为指示菌，利用超滤管能将不同分子量物质分离开来的特性，表7和表8显示，菌株CS1、CS2、CS4的上清液中的抑菌物质主要存在于3～10 kDa，且对于不同病原菌，抑菌物质存在一定差异。结果表明，不同乳酸菌的产物和作用机制有较大的差异，与王伟（2018）试验结果相同。

表7 不同分子量范围的上清液对嗜水气单胞菌的抑制能力

表8 不同分子量范围的上清液对副溶血弧菌的抑制能力

2.8 抗脂质过氧化 由图12可见，与空白相比，加入乳酸菌或其发酵上清的饲料，其抗脂质氧化作用显著提高，单纯加入发酵上清的效果最好。其中，菌株CS4的作用最强。

图12 乳酸菌菌株的抗脂质过氧化作用

从半滑舌鳎肠道中筛选获得的乳酸杆菌菌株CS1、CS2和CS4，具有一定的抵抗病害菌的能力，还可以提高饲料的抗脂质过氧化能力，在水产饲料加工中具有一定的应用潜力。

3 结论

从半滑舌鳎肠道中筛选并鉴定了三株乳酸杆菌菌株CS1、CS2和CS4，对病害菌具有一定的抑制能力，其中，对维氏气单胞菌的作用最强。氨苄青霉素钠和氯霉素对乳酸菌的生长有显著的抑制性；相反，菌株对硫酸链霉素和硫酸盐卡那霉素不敏感。通过排除试验，推测抑菌物质为一种耐热的蛋白质，分子量在3～10 kDa。菌株在低pH和胆盐存在条件下可以生长。菌株发酵液具有抗氧化活性，其在饲料中添加可以显著提高饲料的抗脂质过氧化能力。乳酸杆菌CS1、CS2和CS4在水产养殖以及水产饲料加工中具有一定的应用潜力。