外源性干预VEGF-C表达对肺癌细胞生物学行为的影响及机制

肖跃华，马忠厦，陈宏旺，代传宙，崔鑫鹏，颜慧

1郴州市第一人民医院胸部肿瘤外科，湖南 郴州 422200；2郴州市第一人民医院妇科肿瘤外科

目前，全球死于肺癌的人数逐年增加。据统计，2015年我国肺癌发病率为0.733%，病死率为0.610%，均居世界首位，预计2025年我国死于肺癌的人数将达百万［1］。工业城市与矿区的肺癌发病率最高，在中国，肺癌的5年生存率仅为8%，原因主要为患者确诊时已属晚期，错过最佳治疗时间［2］。肺癌是一种预后极差的疾病，肺癌的发生、发展及细胞侵袭、转移极为复杂［3］。血管内皮生长因子-C（VEGF-C）可刺激内皮细胞增殖，从而诱导血管和淋巴管生成。VEGF-C是淋巴管新生的有力诱导剂，是首个被识别具有促淋巴管新生的特异性作用［4］。研究证实，在多种原发恶性肿瘤（如胃癌、子宫癌、肝癌）组织中VEGF-C表达均高于癌旁组织，可能与淋巴结转移有关。国外已有较多实验报道证实，VEGF-C在癌细胞淋巴结转移中有促进作用［5］，阻断VEGF-C在肿瘤淋巴结转移的这一机制，可能会控制恶性肿瘤的淋巴结转移［6］。有学者进一步证明了VEGF-C在淋巴管生成及肿瘤淋巴结转移中的作用。端粒酶卡扎尔体蛋白1（TCAB1）为端粒酶核心的蛋白组成部分，属于WD40家族一员，可灵活循环介导分子间的相互作用，TCAB1蛋白表达与多种散发性肿瘤风险升高有关。研究发现，TCAB1参与了DNA的损伤应答，可修复损伤的DNA［7］。研究发现，TCAB1在癌细胞中一定程度上过表达［8］，但其在肺癌中的作用机制尚不明确。2020年10月—12月，我们通过离体实验观察了外源性VEGF-C对肺癌细胞生物行为及TCAB1信号作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料肺癌细胞（A549细胞）购于苏州千舍生物科技有限公司；鼠抗人VEGF-C单克隆抗体购于杭州联科美讯生物医药技术有限公司；TCAB1抗体购于巴傲得生物科技有限公司；胎牛血清购自上海冰晴生物科技；MTT试剂盒、二甲基亚砜（DMSO）购自江苏凯基生物技术有限公司；TRIzol购于武汉科昊佳生物科技有限公司；蛋白电泳仪购于济南来宝医疗器械有限公司；RT-PCR试剂盒和仪器购自上海雅吉生物科技有限公司；质粒小量提取试剂盒购于苏州宇恒生物科技有限公司；Transwell小室和基质胶购于宝信生物；流式细胞仪购自北京德利卡生物技术有限公司。

1.2 A549细胞培养将低温冷藏的A549细胞，快速移入37℃水中溶解，离心后，弃上清，加入培养基，37.5℃、5%CO2中培养，贴壁生长，1～2 d更换新的培养液，细胞生长至90%时，加入蛋白液消化，保存备用。

1.3 细胞分组及转染取A549细胞1×106/mL，分为BK组、VC组、SC组。BK组不转染，VC组、SC组均于EP管中放入200 µL转染液体和4 µL脂质体，SC组、VC组分 别加入5 µg的miR-21 mimics、NC mimics，充分混合，转染7 h后备用。

1.4 A549细胞存活率检测采用MTT法。将各组A549细胞按照1×106/mL接种到96板中，更换含有1%的牛血清培养基中同步消化。吸去原培养液，每个浓度6个复孔，均加入5 mg/mL的MTT溶液20µL，培养12、24、48及72 h后，吸弃培养液，再于每个孔中加入50 µL DMSO，摇匀后置于490 nm波长下检测（OD值），取3次平均值，细胞存活率（%）=［A（加药）-A（凋零）］／［A（对照）-A（凋零）］×100%。

1.5 A549细胞侵袭能力检测采用Transwell小室。将各组A549细胞接种于6孔板中，将50 mg/L的基质胶稀释后加入小室上层，37℃下呈凝胶状态，细胞数目为1×106/mL，上室中加入细胞悬液，下室中加入少量胎牛血清培养基，37.5℃培养2 d，取出培养基，拭去残留细胞，现配结晶紫，每孔500µL，将小室放入，25℃染色30 min，PBS清洗1次，稍晾干。显微镜观察样本，连续选5个清晰不同视野进行数量统计，然后计算平均数。

1.6 A549细胞凋亡率检测采用流式细胞仪。将0.25%蛋白酶消化的A549细胞，以5×107/mL个数接种到无牛血清培养基过夜，24 h后，2 000 r/min离心5 min（离心半径6 cm），PBS冲洗3次，100µL接种于5 mL流式试管中，5µL的AnnexinⅤ与5µL的PI混合后染色，无光条件下，孵育15 min后注入400µL结合缓冲液用移液枪轻轻混匀，予以洗涤，实验重复3次，流式细胞仪上机检测，记录细胞凋亡情况。

1.7 A549细胞中TCAB1蛋白表达检测采用免疫印迹法。取A549细胞，给予TCAB1 siRNA干预，作为TC组。将各组A549细胞加入少量胰蛋白酶消化后，500 r/min离心5 min（离心半径6 cm），离心保留上清液，放入样孔中，进行电泳实验。PVDF膜TBS浸泡10 min，反 复PBS冲 洗，每 次5 min，加 入1抗（1∶500），4℃孵育过夜；TBST溶液洗涤5 min×3次；加入相应2抗（1∶2 000），室温孵育30 min，杂交冲洗。后将膜浸入ECL工作液，随后进行检测，获取图象。

1.8 统计学方法 采用SPSS23.0统计软件。计量资料符合正态分布以±s表示，两组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析，不同时间点比较采用重复测量方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组A549细胞存活率比较干预12、24、48、72 h时，BK组与VC组A549细胞存活率比较差异无统计学意义（P均＞0.05），SC组A549细胞存活率低于BK组、VC组，组间比较差异有统计学意义（P均＜0.05），见表1。

表1 各组不同时点A549细胞存活率比较（%，±s）

表1 各组不同时点A549细胞存活率比较（%，±s）

注：与BK组比较，*P＜0.05；与VC组比较，#P＜0.05。

组别BK组VC组SC组A549细胞存活率12 h 100.00 99.71±1.06 81.29±6.59*#24 h 98.76±5.89 92.52±5.92 75.75±6.41*#48 h 95.54±5.68 93.43±5.65 61.38±6.02*#72 h 91.74±5.94 93.79±5.88 57.42±4.63*#

2.2 各组A549细胞侵袭数目比较BK组与VC组A549细 胞侵 袭 数 目 分 别 为（148.04±13.64）、（146.65±12.96）个，两组比较差异无统计学意义（P＞0.05），SC组A549细胞侵袭数目为（104.53±9.87）个，低于BK组、VC组，三组比较差异有统计学意义（F=24.383，P＜0.001）。

2.3 各组A549细胞凋亡率比较BK组与VC组A549细胞凋亡率分别为（8.63±0.84）%、（8.42±0.72）%，两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。SC组A549细胞凋亡率为（19.29±2.08）%，高于BK组、VC组，三组比较差异有统计学意义（F=125.326，P＜0.05）。

2.4 各组A549细胞中TCAB1蛋白表达比较BK组、VC组A549细胞中TCAB1蛋白表达分别为2.03±0.21、1.98±0.20，两组比较差异无统计学意义（P＞0.05），SC组A549细胞中TCAB1蛋白表达为1.35±0.12，低于BK组、VC组（P均＜0.05）。

3 讨论

肺癌是原发于支气管黏膜上皮细胞或肺泡上皮细胞的最常见恶性肿瘤之一，尽管目前针对肺癌的治疗手段逐步提升，但肺癌患者术后的生存率仍较低［9］。造成存活率较低的原因主要有肿瘤细胞的侵袭、增殖、转移、凋亡，其中肿瘤的转移是肿瘤细胞从原发部位通过血管、淋巴管系统向其他器官扩散，这是造成患者死亡的主要原因［10］。有学者发现，某些生长因子介入了癌细胞的侵袭和凋亡过程［11］。本研究前期对肺癌细胞生物学行为及TCAB1信号进行论证、分析，RNAi技术有较好的普遍性及稳定性，沉默效率较高，其中shRNA可更高效地下调目的基因表达。针对VEGF-C与肿瘤细胞增殖、侵袭过程的关系及对TCAB1信号的影响，我们发现VEGFCmRNA在肺癌组织中的表达高于癌旁组织。VEGF-C可介导淋巴血管生成，是一个特异性淋巴管生成因子，在乳腺癌、子宫肿瘤、食管癌中均高表达，并且随着肿瘤恶性程度的增加VEGF-C表达不断增高［12］。刘树库等［13］研究证实，VEGF-C mRNA表达在癌组织及癌旁组织的相对含量高于正常组织。本研究通过免疫印迹法检测A549细胞中TCAB1蛋白表达，结果显示，SC组TCAB1在A549细胞中蛋白表达低于BK组、VC组，TC组与SC组A549细胞中TCAB1蛋白表达差异无统计学意义，说明抑制VEGF-C表达可降低TCAB1表达，其作用效果与敲除TCAB1基因相似。TCAB1是端粒酶关键核心蛋白成分，在肿瘤组织中高表达，TCAB1蛋白表达障碍与罹患多种散发性肿瘤的风险升高有关，对肿瘤的发生、发展有重要作用［14］。有研究发现，TCAB1基因在A549细胞中表达升高，TCAB1能调节肿瘤细胞的放射敏感性，在恶性肿瘤细胞中均异常表达，并可使正常细胞恶化，若外源性降低TCAB1表达可促进肿瘤细胞凋亡［15］。同时VEGF-C siRNA对TCAB1表达有一定影响，VEGF-C siRNA转染肺癌细胞A549可显著抑制TCAB1 mRNA和蛋白表达。戢楠楠等［16］研究证实，TCAB1具有致癌基因的一般特性，可促进肿瘤细胞的发生、发展，但目前其致癌作用机制尚不明确，需进一步研究。

本研究结果显示，BK组、VC组A549细胞在48、72 h的存活率均低于SC组。VEGF-C可使肿瘤细胞进入淋巴管，促进肿瘤因子的转移、存活，在不同阶段有重要作用，表明敲除了VEGF-C后可阻碍其功能发挥，沉默VEGF-C的基因效应持续扩增，可降低癌细胞存活率［17］。郭梦丽等［18］研究证实，VEGF-C基因的siRNA表达载体能抑制VEGF-C基因表达，并可抑制癌细胞增殖，减少癌细胞生存率。本研究表明，SC组A549细胞发生侵袭的细胞数量低于其他两组，说明降低VEGF-C表达可抑制肺癌细胞侵袭。VEGF-C会导致恶性肿瘤或周边淋巴管的增生，从而导致淋巴管扩张不断增大，使癌细胞接触到淋巴管的几率变大；VEGF-C还可调控内皮细胞，使淋巴腔变大，从而使癌细胞迅速进入淋巴管，发生转移［19］。冯瑶瑶等［20］研究发现，宫颈癌中的VEGF-C表达与肿瘤细胞的转移与恶性进展有关，与本研究结果基本相似。有研究表明，VEGF-C siRNA可激活凋亡途径引起癌细胞凋亡，使癌细胞发生G1/S期阻滞，减少癌细胞增殖、存活，表明其在癌细胞的生长中起到抗凋亡作用［18］。徐海等［21］研究证实，子宫内膜中的VEGF-C变化与癌细胞的凋亡有关，VEGF-C可作为治疗子宫内膜癌的特异性靶点，有利于生物治疗的进行，这与本研究结果相似。外源性降低VEGF-C表达可提高A549细胞凋亡数量。

综上所述，外源性降低VEGF-C表达可降低A549细胞存活率及侵袭能力，提高细胞凋亡率；其作用机制可能与抑制TCAB1蛋白表达有一定关系。