胃癌组织中miR-143-3p、LASP1表达与临床病理特征和预后的关系

沈美琴，施颖琦，陆飞，葛振明，钱俊波

南通市第一人民医院消化内科，江苏 南通 226000

胃癌是常见的恶性肿瘤之一。2020年我国胃癌新发病例47.9万例，死亡37.4万例，疾病负担较重［1］。尽管近年来随着内镜技术的普及，早期胃癌的检出率逐年上升，但大多胃癌患者在诊断时已处于进展期，即使接受根治性切除，预后仍较差［2］。因此还需进一步了解胃癌发生、发展的驱动因素。微小RNA（miRNA）通过调控基因转录参与肿瘤发生、发展［3］。miR-143-3p是miRNA家族的一种高度保守成员。研究报道，miR-143-3p在肺癌、口腔鳞癌中异常表达，参与肿瘤细胞恶性进展［4-5］。研究表明，肌动蛋白细胞骨架改变参与肿瘤发生、发展［6］。LIM和Src同源结构域3蛋白1（LASP1）是LIM（LIN11、ISL1、MEC3）蛋白亚家族的一种细胞骨架支架蛋白，参与维持肌动蛋白稳定性［7］。目前，关于胃癌组织中miR-143-3p、LASP1表达与临床病理特征和预后的关系尚少见报道。本研究我们探讨了胃癌组织中miR-143-3p、LASP1表达及其与临床病理特征和预后的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料选取2017年1月—2018年1月本院收治的113例接受姑息性或根治性手术的胃癌患者，其中男52例、女61例，年龄43～78（60.35±6.35）岁；肿瘤部位：贲门或胃底39例、胃体20例、胃窦54例；肿瘤直径：≥3 cm 61例、＜3 cm 52例；分化程度：低分化45例、中高分化68例；TNM分期［8］：Ⅰ期32例、Ⅱ期47例、Ⅲ期34例；淋巴结转移52例。纳入标准：经术后病理检查确诊为胃癌；初诊且入院前未接受抗肿瘤治疗；患者及家属均知情并签署同意书。排除标准：合并其他肿瘤、全身感染、严重心、肝、肾功能损害；年龄＜18岁。本研究经医院伦理委员会批准（2019KS095）。

1.2 胃癌组织中miR-143-3p、LASP1表达检测收集术中切除部分癌组织和癌旁正常组织（距癌组织＞5 cm），TRIzol试剂盒（上海冠泰生物科技有限公司，编号：A2010A0401）提取组织总RNA，Nano-300微量分光光度计（杭州奥盛仪器有限公司）验证纯度、浓度合格，使用反转录试剂盒（日本TaKaRa Bio，编号：RR037B）反转录合成cDNA，反转录体积10µL：5×

PrimeScript RT Master Mix 2.0 µL、RNA 2.0 µL、

RNase Free H2O 6.0µL；反应条件：37℃15 min、85℃5 s、4℃5 min反应至结束后保存于-20℃冰箱中。以cDNA为模板按照SYBR®Premix Ex Taq™试剂盒（日本TaKaRa Bio，编号：RR902A）进行PCR扩增。miR-499a-5p正向引物：5＇-GCGCGCTACAGTATAGATGATG-3＇，反向引物：5＇-GCTGTCAACGATACGCTACG-3＇；内 参U6正 向 引 物：5＇-GCGCGCGCGGGCAGGG-3＇，反向引物：5＇-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3＇；LASP1正向引物：5＇-TGCGGCAAGATCGTGTATCC-3＇，反向引物：5＇-GCAGTAGGGCTTCTTCTCGTAG-3＇；内参GAPDH正向引物：5＇-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3＇，反向引物：5＇-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3＇。引物序列由上海新贝生物科技有限公司设计和合成。PCR反应体积20µL：SYBR®Premix Ex Taq 10µL、正反向引物各0.8 µL、cDNA模板2.0 µL、ROX Reference Dye（50×）0.4 µL、RNase Free H2O 6.0 µL；反应条件：95℃90 s、95℃30 s、63℃30 s、72℃15 s，循环40次后收集Ct。采用2-ΔΔCt法计算组织中miR-143-3p、LASP1 mRNA相对表达量。

1.3 随访所有患者出院后通过门诊或电话方式随访3年，随访截止到2021年1月，根据胃癌组织中miR-143-3p、LASP1 mRNA表达的中位数分为高低表达者，统计不同表达的胃癌患者总生存率。

1.4 统计学方法采用SPSS28.0统计软件。计量资料符合正态分布以±s表示，比较采用t或F检验；偏态分布以M（P25，P75）表示，比较采用U或H检验。采用Spearman相关性系数进行相关性分析；Kaplan-Meier法绘制胃癌患者生存曲线，组间生存率比较采用Log-rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌及癌旁组织中miR-143-3p、LASP1 mRNA表达比较胃癌、癌旁组织中miR-143-3p相对表达量分别为1.42（1.21，1.66）、3.63（2.90，4.33），二者比较差异有统计学意义（U=12.531，P＜0.01）；胃癌、癌旁组织中LASP1 mRNA相对表达量分别为2.12（1.96，2.26）、1.18（1.03，1.32），二者比较差异有统计学意义（U=12.753，P＜0.01）。

2.2 胃癌组织中miR-143-3p与LASP1 mRNA表达的相关性经TargetScan数据库http：//www.targetscan.org/预测发现，LASP1的3'-非翻译区1683至1689碱基处存在与miR-143-3p的结合位点（图1）。Spearman相关性分析显示，胃癌组织中miR-143-3p与LASP1 mRNA表达呈负相关（r=-0.810，P＜0.01）。

图1 miR-143-3p与LASP1的结合位点示意图

2.3 胃癌组织中miR-143-3p、LASP1 mRNA表达与临床病理特征的关系胃癌组织中miR-143-3p、LASP1 mRNA表达呈与TNM分期和淋巴结转移有关（P均＜0.05），见表1。

表1 胃癌组织中miR-143-3p、LASP1 mRNA表达与患者临床病理特征的关系

2.4 胃癌组织中miR-143-3p、LASP1 mRNA表达与患者预后的关系随访3年，113例胃癌患者中死亡35例，无失访病例，总生存率为69.03%（78/113）。Kaplan-Meier生存曲线分析显示，miR-143-3p高表达（≥1.42）者57例，3年总生存率为82.46%（47/57）；miR-143-3p低表达（＜1.42）者56例，3年总生存率为55.36%（31/56），miR-143-3p高表达者与低表达者3年总生存率比较差异有统计学意义（χ2=9.735，P＜0.05）。LASP1 mRNA高表达（≥2.12）者55例，3年总生存率为58.18%（32/55）；LASP1 mRNA低表达（＜2.12）者58例，3年总生存率为79.31%（46/58），LASP1 mRNA高表达者与低表达者3年总生存率比较差异有统计学意义（χ2=6.511，P＜0.05）。

3 讨论

胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，我国70.8%的初诊胃癌存在局部进展［9］，晚期胃癌患者5年累积生存率不足30%［10］。近年来，以个体化、精准化为特征的免疫和靶向治疗虽然为进展期胃癌的治疗提供了新的方向，但尚未达到满意效果。对部分进展期胃癌和晚期胃癌疗效仍然较差，有必要进一步了解胃癌发生、发展的相关分子机制，不仅有助于胃癌进展和预后评估，亦有助于开放新的治疗方案，对延长胃癌患者生存期有重要意义。

非编码RNA组成了生物体细胞内复杂的RNA调控网络，广泛参与肿瘤细胞各种生物学过程，miRNA是一种新发现的小分子非编码RNA，通过与mRNA的3'-非翻译区结合而降解或抑制其翻译而参与基因调控，在肿瘤中发挥癌基因或抑癌基因功能［11-12］。miR-143-3p定位于人染色体5q32，是一种高度保守的miRNA。近年多项研究报道其与恶性肿瘤的关系，如郭亮等［13］研究报道，miR-143-3p在前列腺癌中低表达，能靶向三叶因子3抑制前列腺癌细胞增殖。WANG等［14］研究报道，miR-143-3p在脑转移瘤中高表达，能靶向调控血管抑制素-1促进脑转移瘤侵袭。这些研究提示，在不同肿瘤中miR-143-3p发挥不同作用。本研究结果显示，胃癌组织中miR-143-3p表达下调，提示miR-143-3p可能在胃癌发生、发展中发挥作用，其在胃癌中表达下调可能与miR-143-3p启动子甲基化有关。进一步分析显示，胃癌组织中miR-143-3p表达下调、TNM分期增加和淋巴结转移有关，提示miR-143-3p在胃癌中发挥抑癌基因作用，其低表达能促进胃癌进展，可能与miR-143-3p下调导致丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶7上调有关。炎症是肿瘤发生、发展的关键机制之一，丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶7是炎症信号转导的关键介质，能被多种细胞因子刺激激活，促进核因子-κB活化，进而促进肿瘤进展［15-16］。FAN等［17］研究证实，胃癌中miR-143-3p能靶向下调丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶7，抑制胃癌细胞增殖、侵袭和迁移，而抑制miR-143-3p能发挥相反作用。

肌动蛋白是一类存在所有真核细胞中的微丝球状多功能蛋白质，能在细胞骨架和肌纤维中形如细丝，以维持细胞形态和保护细胞内部结构，进而参与诸多重要生命活动。当肌动蛋白细胞骨架异常时可引起细胞形态和结构紊乱，促进细胞异常增殖、迁移，在肿瘤发生、发展过程中发挥重要作用［6］。LIM是参与调节肌动蛋白细胞骨架形成的半胱氨酸富集蛋白，LASP1作为LIM蛋白亚家族的一员，在维持肌动蛋白稳定性中发挥重要作用，当细胞骨架异常时可引起LASP1大量表达［18-19］。研究发现，LASP1还存在于信号转导蛋白和转录因子中，能介导细胞内信号转导，同时基于肌动蛋白细胞骨架与肿瘤的密切关系。研究发现，LASP1表达上调与恶性肿瘤的增殖、迁移和侵袭有关［20-21］。近年研究发现，沉默LASP1能抑制胃癌细胞增殖、侵袭和转移能力。然而鲜见研究报道LASP1对胃癌的临床意义。本研究结果显示，胃癌组织中LASP1表达上调，这与刘玉珍等［22］报道一致，提示LASP1可能在胃癌发生、发展中发挥作用，其在胃癌中表达上调可能与胃癌细胞异常增殖等破骨细胞骨架有关。进一步分析显示，胃癌组织中LASP1表达上调、TNM分期增加和淋巴结转移有关，提示LASP1在胃癌中发挥促癌基因作用，其机制可能与LASP1表达上调反映胃癌细胞骨架异常，导致肿瘤细胞异常增殖、迁移。近年研究发现，下调LASP1表达能通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B途径抑制细胞增殖和迁移，导致细胞周期停滞［23-24］。本研究分析miR-143-3p、LASP1 mRNA与胃癌患者预后关系发现，miR-143-3p高表达和LASP1 mRNA低表达胃癌患者生存率更高，说明miR-143-3p和LASP1或可成为胃癌患者预后评估指标。本研究通过TargetScan数据库预测发现，LASP1的3'-非翻译区与miR-143-3p的结合位点，相关性分析也发现，胃癌组织中miR-143-3p与LASP1 mRNA表达呈负相关，提示miR-143-3p与LASP1可能共同参与胃癌发生、发展。许鑫鑫等［25］通过实验也证实，上调miR-143-3p能靶向下调LASP1，抑制胃癌细胞的侵袭和迁移。本研究结果与之相符。

综上所述，miR-143-3p在胃癌中低表达，LASP1 mRNA在胃癌中高表达，二者可能共同参与胃癌进展，与TNM分期、淋巴结转移和预后有关，但本研究结果有待多中心进一步研究证实。